碱性成纤维细胞生长因子表达与宫颈鳞癌局部微血管淋巴管密度、转移及预后的相关性研究

　　　　 作者：林岷， 江忠清， 连成瑛， 郑秀， 宋丽

【摘要】 　　目的 探讨宫颈鳞状细胞癌(SCC)组织碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达与局部血管淋巴管生成、转移及预后的关系。 方法 采用免疫组织化学SP法检测28例正常宫颈上皮(NCE)、36例宫颈上皮内瘤变(CIN)和68例SCC组织bFGF表达，并检测Ki67增殖指数(PI)、CD34微血管密度(MVD)及VEGFR3微淋巴管密度(LMVD)。 结果 从NCE到CIN再到SCC，bFGF表达水平、PI、MVD及LMVD均显著升高(P<0.05)。bFGF在SCC组表达与MVD显著正相关，并与盆腔淋巴结转移及脉管浸润密切相关(P<0.05)，而与患者年龄、FIGO分期、组织学分级、间质浸润深度、预后、PI及LMVD无关(P>0.05)。SCC有盆腔淋巴结转移及脉管浸润者，其bFGF表达水平分别显著高于无盆腔淋巴结转移及无脉管浸润者(P<0.05)。 结论 bFGF表达与SCC局部微血管密度及转移状况呈正相关，提示bFGF可能在SCC局部血管生成及浸润转移过程中发挥重要作用。

【关键词】 宫颈肿瘤； 癌状细胞； 成纤维细胞生长因子2； 新生血管化，病理性; 淋巴管； 淋巴转移

　　碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor/fibroblast growth factor2，bFGF /FGF2)是一种多肽生长因子，广泛存在于人体多种组织，对中胚层和神经外胚层来源的细胞具有明显的促增殖作用，在机体胚胎发育、血管形成、创伤修复等过程中起着重要的调节作用。bFGF与细胞外基质降解、肿瘤细胞侵袭与运动、肿瘤血管生成及肿瘤细胞生长、增殖、凋亡等均有密切关系[1]。近来研究表明，bFGF可能参与淋巴管生成[2]。笔者采用免疫组织化学SP法和图像分析技术检测bFGF在宫颈鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of cervix，SCC)组织的表达，探讨其表达与局部血管淋巴管生成、癌细胞增殖、侵袭转移及预后的关系。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 选自1998年3月-2005年6月手术的宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasm，CIN)36例和SCC 68例作为研究对象。所选对象术前均经病理确诊，未经过化疗、放疗及免疫治疗。选取28例因功能失调性子宫出血或子宫肌瘤行子宫切除术的正常宫颈上皮(normal cervical epithelium，NCE)作为对照。CIN分级及SCC组织学分级和FIGO分期参照文献[3]，脉管浸润的判断标准参照文献[4]。SCC患者年龄（44.5±9.4）岁（24～72岁），<45岁者30例，≥45岁者38例；CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ级分别为12、11和13例(其中原位癌4例)；SCC FIGO分期Ⅰ期32例，Ⅱ期36例；组织学分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别2、19和47例；脉管浸润34例；盆腔淋巴结转移17例；镜下早期浸润癌5例，浸润癌63例(浅、深肌层浸润各15和48例)。截止2006年12月底，对68例SCC患者随访，共随访到53例，随访率77.94%，随访时间中位数54.8月(5～93月)。随访中死亡14例，3年生存率74.51％(38/51)，5年生存率67.44％(29/43)。

　　1.2 试剂 浓缩型兔抗人bFGF多克隆抗体(NeoMarkers公司产品，工作浓度1∶150)。即用型鼠抗人Ki67单克隆抗体(克隆号MIB1)、即用型鼠抗人CD34单克隆抗体(克隆号QBEnd/10)、超敏免疫组织化学染色试剂盒和DAB染色剂(福州迈新生物技术有限公司)。

　　1.3 方法 所有新鲜标本均经4％甲醛溶液固定，48 h内取材，石蜡包埋，连续3～5 μm厚度切片。采用免疫组织化学SP法检测CIN和SCC组织bFGF、Ki67和CD34的表达情况。按说明书操作。bFGF、Ki67和CD34均采用枸橼酸缓冲液高压热力修复抗原，DAB显色，苏木精对比染色，但bFGF未行苏木精对比染色。用已知阳性片作为阳性对照，用PBS代替第一抗体作为阴性对照。

　　1.4 结果判断 bFGF在细胞质和细胞膜表达，阳性染色者细胞质和细胞膜呈棕黄色。用JD801图像分析系统测定每张切片9个200倍视野bFGF阳性染色区(在NCE中选取正常上皮，在CIN中选取异型上皮，在SCC中选取癌巢组织)的灰度值和光密度值，以平均光密度值表示bFGF表达水平。CD34表达于血管内皮细胞质，呈棕黄色染色，CD34标记的微血管密度(microvessel density，MVD)判断标准参照文献[4]。Ki67在细胞核表达，阳性染色者细胞核呈棕黄色。VEGFR3阳性染色主要位于肿瘤边缘及间质微淋巴管内皮细胞质，呈棕黄色染色，微淋巴管内皮细胞围成壁薄、形态不规则的管腔结构，内无红细胞。Ki67标记的增殖指数(proliferation index，PI)和VEGFR3标记的微淋巴管密度(lymphatic microvessel density，LMVD)判断标准参照文献[5]。

　　1.5 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件分析，定量资料比较采用方差分析，二元变量间的关系采用相关分析，生存情况采用KaplanMeier曲线表示，Log rank检验。检验水准α=0.05，以P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 bFGF在NCE、CIN及SCC组的表达 从NCE到CIN再到SCC，bFGF表达水平显著升高(P<0.01，表1)。bFGF在NCE中主要表达于上皮细胞膜和细胞质(图1A)。bFGF在CIN中主要表达于异形细胞膜和细胞质(图1B)，其在CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ的表达水平分别为（0.1198±0.0140）、（0.1271±0.0160）、（0.1211±0.0200），各级之间相互比较差别无统计学意义(P>0.05)。bFGF在SCC中主要表达于癌细胞膜和细胞质(图1C)。bFGF除在上述细胞表达外，在上皮下或癌巢间质成纤维母细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞等的细胞膜和细胞质也有表达。

　　表1 bFGF在NCE、CIN及SCC组的表达（略）

　　Tab 1 Expression of bFGF in NCE， CIN and SCC groups

　　NCE：正常宫颈上皮；CIN：宫颈上皮内瘤变；SCC：宫颈鳞状细胞癌；bFGF:碱性成纤维细胞生长因子. 与NCE组比较，☆：P<0.01；与CIN组比较，△：P<0.01.

　　2.2 Ki67、CD34和VEGFR3分别在NCE、CIN及SCC组表达 在NCE、CIN及SCC组，PI分别为（96.0±54.6）、（300.0±157.1）及（378.7±199.6）；MVD分别为（6.3±2.9）、（18.0±4.7）及（58.2±19.6）；LMVD分别为（2.2±3.8）、（6.4±5.7）及（8.3±2.8）。从NCE到CIN再到SCC，PI、MVD及LMVD均显著升高(P<0.05)。Ki67、CD34及VEGFR3在SCC组表达分别见图1D～F。

　　bFGF：碱性成纤维细胞生长因子；NCE：正常宫颈上皮；CIN；宫颈上皮内瘤变；SCC：宫颈鳞状细胞癌；VEGFR3：血管内皮生长因子受体3. A：bFGF在NCE呈阳性表达(×200)，上皮细胞质和细胞膜被染色呈黄棕色；B：bFGF在CINⅢ呈阳性表达(×400)，异型上皮细胞质和细胞膜被染色呈黄棕色；C：bFGF在SCC呈阳性表达(×200)，癌细胞质和细胞膜被染色呈黄棕色；D：Ki67在SCC呈阳性表达(×200)，癌细胞核被染色呈黄棕色；E：CD34在SCC间质血管中呈阳性表达(×200)，癌巢间质血管内皮细胞质被染色呈黄棕色；F：VEGFR3在SCC边缘淋巴管呈阳性表达(×400)，淋巴管内皮细胞质被染色呈黄棕色.

　　图1 bFGF、Ki67、CD34和VEGFR3在SCC中表达（略）

　　Fig 1 Expression of bFGF，Ki67，CD34 and VEGFR3 in SCC group

　　2.3 bFGF在CIN及SCC组表达分别与PI、MVD及LMVD的关系 将bFGF在CIN及SCC组表达均以中位值为界分为高和低表达组。在CIN中，bFGF高表达组PI、MVD及LMVD分别与低表达组比较，差别均无显著性(P>0.05，表2)。在SCC中，bFGF高表达组MVD与低表达组比较，差别有显著性(P<0.01，表2)，而bFGF高表达组PI及LMVD分别与低表达组比较，差别均无显著性(P>0.05，表2)。相关分析显示，bFGF在CIN中表达均分别与PI、MVD及LMVD无显著相关性(PI：r=0.083，P=0.640；MVD：r=0.097，P=0.575；LMVD：r=0.186，P=0.278)；bFGF在SCC中表达与MVD显著正相关(r=0.326，P=0.007)，而与PI及LMVD均无显著相关性(PI：r=0.037，P=0.767；LMVD：r=0.154，P=0.211)。

　　表2 bFGF 在CIN及SCC组表达分别与PI、MVD及LMVD的关系（略）

　　Tab 2 Association of bFGF with PI， MVD and LMVD in CIN and SCC groupsbFGFPIMVDLMVD

　　CIN：宫颈上皮内瘤变；SCC：宫颈鳞状细胞癌；PI：增殖指数；MVD：微血管密度；LMVD：微淋巴管密度；bFGF：碱性成纤维细胞生长因子. 与低表达组比较，☆：P<0.01.

　　2.4 bFGF 在SCC组表达与临床病理特征的关系 bFGF在不同年龄、FIGO分期、组织学分级及浸润深度的SCC中表达没有显著差别(P>0.05，表3)，而在有无盆腔淋巴结转移和脉管浸润者中表达有显著性差别(P<0.05，表3)。SCC有盆腔淋巴结转移及脉管浸润者，其bFGF表达水平显著高于无盆腔淋巴结转移和无脉管浸润者(P<0.05，表3)。

　　2.5 bFGF在SCC组表达与预后的关系 bFGF高和低表达SCC患者KaplanMeier生存曲线见图2。bFGF高表达患者生存率与低表达组比较差别无显著性，Log rank检验，P=0.633。

　　SCC：宫颈鳞状细胞癌；bFGF：碱性成纤维细胞生长因子.

　　图2 宫颈鳞状细胞癌bFGF高表达和低表达组患者KaplanMeier生存曲线（略）

　　Fig 2 KaplanMeier survival curve in SCC patients with the higher and lower bFGF expression

　　表3 bFGF在SCC组表达与临床病理特征的关系（略）

　　Tab 3 Relationship between bFGF expression and clinicopathologic characteristic in SCC group

　　SCC:宫颈鳞状细胞癌; bFGF:碱性成纤维细胞生长因子. 在有无盆腔淋巴结转移及脉管浸润组间比较，☆:P<0.05.

　　3 讨论
　　
　　bFGF基因定位于染色体4q264q27，长34 kb，由3个外显子和2个内含子组成[6]。体内几乎所有细胞如成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞等均能产生bFGF，bFGF与其受体结合后在机体各组织产生广泛的生物学效应和生理病理作用。bFGF具有促进细胞有丝分裂和诱导新生血管生成的作用，与肿瘤生长分化、浸润转移及血管生成密切相关[1]。笔者研究显示，从NCE到CIN再到SCC，bFGF表达水平显著升高(P<0.01)，提示宫颈上皮细胞从受损到癌变，bFGF合成显著增加，bFGF过表达可能参与SCC的发生发展。
　　
　　bFGF是除VEGF以外最主要的促肿瘤血管生长因子之一。人体微量bFGF可调节细胞DNA合成、促有丝分裂和刺激血管生长；在致癌因素作用下人体细胞发生恶变，恶变组织局部bFGF表达上调，进而促进血管新生，增加血液供应，为肿瘤细胞快速无限增殖提供养分，进一步促进肿瘤生长[1]。笔者结果显示，bFGF在SCC组表达与MVD显著正相关(P<0.01)，而在CIN组表达与MVD无显著相关性(P＞0.05)。提示在CIN血管生成中bFGF可能不起主要作用，而在SCC阶段，bFGF过表达可促进肿瘤血管新生。小鼠角膜在低浓度bFGF刺激下可引起淋巴管新生，而高浓度bFGF则主要引起血管新生，并进一步证实bFGF通过上调VEGFC表达引起淋巴管新生，采用VGFR3抗体可阻断bFGF诱导的淋巴管新生[2]。笔者结果显示，从NCE到CIN再到SCC，LMVD显著升高(P<0.01)，但bFGF在CIN及SCC组表达均分别与LMVD无显著相关性(P>0.05)。故笔者认为，bFGF在宫颈上皮恶变过程中表达升高可能通过上调VEGFC表达而促进淋巴管生成，但当bFGF表达进一步升高以后则可能主要促进血管新生而不是淋巴管生成。
　　
　　Whitham等观察了8株人肿瘤细胞对bFGF反应，发现bFGF在一定浓度范围内促进肿瘤细胞增殖，但随浓度增加，反而呈现抑制生长现象[7]。高航等报道宫颈癌bFGF过表达并不增加PCNA表达[8]。笔者结果显示，bFGF在CIN及SCC组表达均分别与PI无显著相关性(P>0.05)。推测bFGF可能通过诱导肿瘤血管新生而不是直接促进癌细胞增殖而促进SCC进展。bFGF表达与肿瘤淋巴结转移、脉管浸润[9]、预后等密切相关[10]。笔者结果显示，bFGF表达在SCC有否盆腔淋巴结转移及脉管浸润者中差异显著，SCC有盆腔淋巴结转移和脉管浸润者bFGF表达显著高于无盆腔淋巴结转移和无脉管浸润者(P<0.05)。何利丽等报道胰腺癌bFGF表达升高与预后无关[11]。笔者也发现，bFGF在SCC组表达与患者生存率无显著相关性(P＞0.05)。甚至有研究发现，bFGF高表达与更长生存期相关[12]。Soufla等报道FGF2 mRNA表达显著降低与宫颈癌恶性转化有关[13]。近年来发现，bFGF对肿瘤除具有促增殖及迁移作用外，更具有促分化及促凋亡作用，并抑制其非锚定的依赖性生长、侵袭和迁移等作用[14]，可见bFGF调控肿瘤生长具有多效性和复杂性。

参考文献

　　目的 探讨宫颈鳞状细胞癌(SCC)组织碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达与局部血管淋巴管生成、转移及预后的关系。 方法 采用免疫组织化学SP法检测28例正常宫颈上皮(NCE)、36例宫颈上皮内瘤变(CIN)和68例SCC组织bFGF表达，并检测Ki67增殖指数(PI)、CD34微血管密度(MVD)及VEGFR3微淋巴管密度(LMVD)。 结果 从NCE到CIN再到SCC，bFGF表达水平、PI、MVD及LMVD均显著升高(P<0.05)。bFGF在SCC组表达与MVD显著正相关，并与盆腔淋巴结转移及脉管浸润密切相关(P<0.05)，而与患者年龄、FIGO分期、组织学分级、间质浸润深度、预后、PI及LMVD无关(P>0.05)。SCC有盆腔淋巴结转移及脉管浸润者，其bFGF表达水平分别显著高于无盆腔淋巴结转移及无脉管浸润者(P<0.05)。 结论 bFGF表达与SCC局部微血管密度及转移状况呈正相关，提示bFGF可能在SCC局部血管生成及浸润转移过程中发挥重要作用。