同种异体免疫反应对ITAC及其受体表达诱导的体外研究

　　　　 作者：祝先进 宋艳芳 ， 许伟群， 张秋玉， 苏东辉

【摘要】 　　目的 探讨同种异体免疫反应对干扰素诱导的T细胞α亚族趋化剂（ITAC）及其受体CXCR3的表达的影响。 方法 同种异体外周血单个核细胞（PBMC）混合培养后，将培养上清液作用于ECV304细胞系，RTPCR检测ECV304的ITAC mRNA表达，ELISA检测培养上清液中IFNγ和TNFα浓度，流式细胞术检测PBMC表面CXCR3的表达。 结果 与单独PBMC培养组相比，混合PBMC培养组上清液中细胞因子干扰素γ（IFNγ）、肿瘤坏死因子α（TNFα）的表达显著升高，且能促进ECV304细胞ITAC mRNA的表达；混合培养后PBMC表面CXCR3的表达亦呈显著升高。 结论 同种异体免疫反应可能通过细胞因子、趋化因子ITAC及其在T细胞上的受体CXCR3的表达，以正反馈形式加剧同种异体移植排斥反应。

【关键词】 移植，同种； 趋化因子类； 受体，趋化因子； 内皮细胞； 内皮，血管； 脐静脉

　　在器官移植中，受者T细胞被募集并穿过血管内皮细胞层进入移植物是宿主抗移植物急性和慢性移植排斥反应发生的最重要条件。干扰素诱导的T细胞α亚族趋化剂（IFNinducible T cell alpha chemoattractant，ITAC）是不久前发现的一种趋化因子，又称为CXCL11，其受体是CXCR3，主要表达于Th1细胞表面。ITAC已被证实对Th1细胞具有强大的募集作用，因此被认为是引起移植排斥的关键因素之一[13]。已有研究显示，IFNγ能够诱导星形胶质细胞、支气管上皮细胞、血管内皮细胞等表达ITAC[3]。本研究以人细胞株ECV304和人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）作为研究对象，通过体外混合淋巴细胞培养，建立模拟移植排斥反应的体外实验模型，研究同种异体免疫反应过程中，ITAC及其受体CXCR3表达的变化，藉此探讨ITAC在移植排斥中的作用，为移植排斥的治疗提供新依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 主要试剂 RPMI1640培养基和胰蛋白酶（美国Hyclone公司），鼠IgG1FITC（美国 R&D公司），鼠抗人CXCR3FITC（美国Research & Diagnostics Systems 公司），Trizol（美国Invitrogen公司），一步法RTPCR试剂盒（美国Promega公司），TNFα ELISA试剂盒和IFNγ ELISA（深圳晶美生物工程有限公司）。

　　1.1.2 主要仪器 PCR扩增仪（2400型，美国PE公司），流式细胞仪（美国Coulter公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 ECV304细胞的培养 ECV304细胞为福建医科大学生物医药中心提供。复苏细胞加RPMI1640培养液（含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素链霉素），置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。

　　1.2.2 PBMC的分离和培养 Ficoll法分离PBMC，加RPMI1640培养液，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。

　　1.2.3 同种异体PBMC的混合培养 将取自不同健康志愿者A和B的PBMC浓度调整为1×106 mL-1，将PBMCA和PBMCB混合培养于含20% FBS的RPMI1640完全培养液中。同时设单独PBMCA和单独PBMCB的细胞培养组。置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养12 h。离心，取各组细胞、上清备用。

　　1.2.4 RTPCR ECV304细胞接种到六孔细胞培养板，待长满80%，加入1.2.3所得各组细胞培养上清液1 mL。A组：加入单独PBMCA培养上清；B组：加入单独PBMCB培养上清；A+B组：加入PBMCA和PBMCB混合培养上清；C组：对照组，即加入细胞培养液。继续培养12 h。按Trizol说明书，一步法提取细胞总RNA，并进行纯度分析、定量及琼脂糖凝胶电泳观察。D260nm/D280nm限制在1.8～2.0。Promega一步法试剂盒进行RTPCR操作。引物序列：ITAC（218 bp）
　　
　　上游：5’GCTATAGCCTTGGCTATATTG3’
　　
　　下游：5’GATTTGGGATTTAGGCATAGTTGT3’

　　反应体系：无核酸酶水5.5 μL，5×Buffer 5 μL，dNTP 0.5 μL，MgSO4 2 μL，AMV反转录酶0.5 μL，Tfl DNA聚合酶0.5 μL，上下游引物各5 μL，模板1 μL。反应条件：反转录45 ℃ 45 min；预变性94 ℃ 2 min；循环94 ℃ 30 s→55 ℃ 45 s→68 ℃ 45 s，共35个循环；68 ℃延伸7 min。取PCR产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳。

　　1.2.5 CXCR3的流式细胞术分析 取1.2.3所得细胞于小试管中，分组为：A组：单独PBMCA培养；B组：单独PBMCB培养；A+B组： PBMCA和PBMCB混合培养。用PBS缓冲液（含有0.5％BSA）洗涤3次，调整细胞浓度到2×105 mL-1，加入1 mL的PBS缓冲液，吹打成单细胞悬液。加入人IgG于单细胞悬液中（每105个细胞加入人IgG 1 μg），室温放置15 min。洗涤1次。加入直标抗体：各管中加入鼠抗人CXCR3FITC 10 μL，同型对照组的一管加入鼠IgG1FITC，2～8 ℃下共孵40 min。每小管加入PBS缓冲液2～3 mL，洗涤3次。用0.5 mL PBS缓冲液重悬细胞，上机检测。

　　1.2.6 同种异体PBMC混合培养上清中IFNγ和TNFα的检测 取1.2.3所得细胞培养上清，用双抗体夹心ELISA法检测TNFα、IFNγ，具体操作严格按说明书进行。

　　1.3 统计学处理 数据以x±s表示。采用单因素方差分析和t检验进行统计分析，P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 同种异体PBMC混合培养上清诱导ECV304细胞ITAC mRNA的表达 混合细胞培养上清(A+B)诱导ECV304细胞ITAC mRNA的表达，而单独细胞的培养上清(A，B)和培养液(C)作用的ECV304细胞均未见ITAC表达(图1)。

　　ITAC：T细胞及亚族趋化剂. M：标准分子量DNA；A+B组：加入PBMCA和PBMCB混合培养上清；A组：加入单独PBMCA培养上清；B组：加入单独PBMCB培养上清；C组：对照组.

　　图1 混合细胞培养上清对ECV304细胞ITAC mRNA表达的诱导作用（略）

　　Fig 1 The expression of ITAC mRNA in ECV304 induced by the culture supernatant from mixed PBMC

　　2.2 同种异体混合细胞培养后PBMC上CXCR3表达的变化 混合细胞培养后PBMC上CXCR3表达与单独PBMC培养A/B组相比明显提高（49.200±3.439 vs 41.633±0.950/42.633±2.948），二者差别有统计学意义（P<0.05，图2）。

　　2.3 同种异体PBMC混合培养上清中IFNγ和TNFα的检测 混合细胞培养上清中IFNγ和TNFα的浓度分别为（119.358±12.447）pg/mL和（1623.76±375.360）pg/mL，与单独培养组IFNγ和TNFα的浓度[取PBMCA和PBMCB 2组的均数，分别为（36.832±12.462）pg/mL和（664.978±95.667）pg/mL]，相比显著升高（P<0.05）。

　　PBMC：人外周血单个核细胞. A:单独PBMCA培养组；B:单独PBMCB培养组；A+B：混合PBMC培养组.

　　图2 混合培养后PBMC上CXCR3的表达（略）

　　Fig 2 The expression of CXCR3 in PBMC

　　3 讨论
　　
　　同种异体器官移植日益成为各种慢性不可逆终末期疾病的一种有效的治疗模式，移植最大的难题是如何克服免疫排斥反应。已经明确，移植物单个核细胞浸润是细胞性排斥反应的重要病理学特征，趋化因子在循环血液中单个核细胞穿过内皮细胞向移植物定向迁移与浸润的过程中扮演重要作用。新近研究发现，ITAC对Th1细胞是一种重要的趋化因子，在动物肾、心脏、皮肤移植术后ITAC均有表达或表达升高，ITAC/CXCR3基因敲除或用抗体封闭CXCR3能够延长移植物的存活时间[47]。因此它在移植排斥反应中的作用颇受关注。
　　
　　血管内皮细胞是白细胞迁移进入移植物第一道屏障，它对细胞因子具有高度反应性，并表达与淋巴细胞配体相互作用的多种分子。它的特殊性决定在免疫应答中充当关键角色，设想它可能参与产生与分泌ITAC，募集PBMC并诱导其与血管内皮细胞的相互作用并最终穿越血管内皮到达病变局部参与同种异体免疫应答。
　　
　　本研究采用混合淋巴细胞培养技术，是移植排斥反应中机体对抗原识别的一种重要的体外模式，可以避免感染、用药及其它诸多因素导致的细胞因子水平的变化。在此反应中，淋巴细胞的增生及某些细胞因子的释放，在一定程度上可预示体内的排斥反应情况[8]。实验中，笔者运用混合培养同种异体的PBMC培养上清液去刺激ECV304细胞，发现混合细胞培养上清液能够诱导ECV304表达ITAC mRNA，同时培养上清中IFNγ、TNFα等细胞因子表达亦有明显升高，而单独培养的PBMC细胞仅分泌少量的IFNγ和TNFα，不足以刺激ECV304细胞表达ITAC，所以一般在正常情况下体内ITAC的量很低。同时还发现混合培养后淋巴细胞表面ITAC受体CXCR3表达明显增高。这些结果提示在同种异体移植排斥反应发生时，淋巴细胞可大量分泌IFNγ、TNFα等细胞因子，这些细胞因子作用于血管内皮细胞，刺激并促进ITAC表达，同时淋巴细胞表面ITAC受体CXCR3表达亦有升高，使ITAC的促趋化功能得以发挥，进一步加强同种异体免疫排斥反应，产生更多细胞因子，作用于血管内皮细胞。这样就形成一个正反馈机制，使同种异体免疫反应不断加强，从而引起移植组织的损伤。推测抑制ITAC及其受体CXCR3的表达可能是一种新的抗移植排斥的途径。这些结果是否能在体内实验中得以确定，有待深入研究。
　　
　　值得提及的是，ECV304细胞系多年来一直被作为人静脉内皮细胞株广泛用于实验研究。虽然新近的基因图谱研究揭示其实际上是派生的膀胱癌细胞系，ECV304之所以仍为许多国内外学者所采用，是基于该细胞系具有人内皮静脉细胞的一些特性，特别是在感染中显示与人静脉细胞具有相同的反应[9]。笔者的研究也许扩展了对该细胞系特性的了解。更准确反映静脉内皮细胞ITAC的表达情况宜采用原代培养的人静脉细胞进行。

参考文献

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　　[2] 祝先进. 一种新的趋化因子ITAC[J]. 国际免疫学杂志，2006，29（5）:330334.

　　[3] Mohan K，Ding Z，Hanly J，et al. IFNgammainducible T cell alpha chemoattractant is a potent stimulator of normal human blood T lymphocyte transendothelial migration: differential regulation by IFNgamma and TNFalpha[J]. J Immunol，2002，168(12):64206428.

　　[4] Zhao D X，Hu Y，Miller G G，et al. Differential expression of the IFNgammainducible CXCR3binding chemokines， IFNinducible protein 10， monokine induced by IFN， and IFNinducible T cell alpha chemoattractant in human cardiac allografts: association with cardiac allograft vasculopathy and acute rejection[J]. J Immunol， 2002，169(3):15561560.

　　[5] Ming J K，Wang X B，Huang B J，et al. Peptide nucleic acid antisense prolongs skin allograft aurvival by means of blockade of CXCR3 expression direction T cell Into graft[J]. J Immunol， 2003，170(3):15561565.

　　[6] Kao J， Kobashigawa J，Fishbein M C，et al. Elevated serum levels of the CXCR3 chemokine ITAC are associated with the development of transplant coronary artery disease[J]. Circulation， 2003，107(15):19581961.

　　[7] 祝先进，张秋玉，许伟群，等. 霉酚酸对趋化性细胞因子ITAC的表达及其功能的影响[J]. 现代免疫学，2006，26（2）：127131.

　　[8] Danzer S G，Kirchner H，Rink L．Cytokine interactions in human mixed lymphocyte culture[J]．Transplantation，1994，57(11)：1638 1642.

　　[9] Ettelaie C， Collier M E， James N J，et al. Induction of tissue factor expression and release as microparticles in ECV304 cell line by Chlamydiapneumoniae infection[J]. Atherosclerosis， 2007，190(2):343351.