化学去细胞肌肉促进大鼠脊髓半横断后的轴突再生

　　　　 作者：薛辉，陈东，张秀英，刘颖

【摘要】 目的 探讨化学去细胞肌肉支架移植后对大鼠损伤脊髓轴突再生的促进作用。方法 将24只成年雄性大鼠制成脊髓半横断损伤模型后，脊髓缺损处分别植入化学去细胞肌肉、冻融去细胞肌肉和新鲜肌肉，空白组不做处理。术后4周，银染观察脊髓轴突的再生情况，对移植物中再生轴突进行计数，做统计学分析并用锇酸染色鉴定化学去细胞肌肉支架中的有髓神经纤维。另取6只化学去细胞肌肉治疗的模型鼠分别行HRP顺行和逆行示踪，1周后观察脊髓上行和下行轴突再生的情况。结果 移植术后4周，空白组无脊髓再生轴突，化学去细胞肌肉中有大量再生的轴突，而冻融去细胞肌肉和新鲜肌肉中的再生轴突很少。锇酸染色显示化学去细胞肌肉中的有髓神经纤维较少。HRP示踪证明化学去细胞支架再生的轴突来自于其上下两端的脊髓。结论 化学去细胞肌肉支架可显著促进损伤脊髓的轴突再生。

【关键词】 脊髓损伤；去细胞肌肉；移植；轴突再生

　　ABSTRACT: Objective To evaluate effects of chemically extracted acellular muscle graft in promoting axonal regeneration after spinal cord hemisection in adult rats. Methods Totally 24 male rats underwent spinal cord lateral hemisection. Treatment consisted of application of chemically extracted acellular muscle graft (CEAM)， freezethawed acellular muscle graft (FAM)， or fresh muscle graft (FM) into the lesion gap， which was left empty in lesion group (L). Rats in each group were killed 4 weeks after induction of the injury. Holmes silver staining method was performed to detect axonal regeneration. Axons in the grafts of each group were quantified， and the results were analyzed statistically. Myelinated nerve fibers in CEAM were shown by osmication staining. In another set of six rats treated with CEAM， regeneration of descending and ascending spinal fibers one week after transplantation was determined by anterograde and retrograde HRP labeling. Results In all the nonimplanted animals， no definite axonal outgrowth into the lesion was found. Many regenerating axons were noted to extend into the CEAMimplanted lesion， while the number of regenerating axons in the FAM or FM was greatly reduced. However， myelinated nerve fibers in CEAM were relatively few. HRP tracing demonstrated that the CEAM grafts could promote the regeneration of descending and ascending axons in spinal cord. Conclusion CEAM can promote robust regrowth of axons in spinal cord.

　　KEY WORDS: spinal cord injury; acellular muscle; transplantation; axon growth

　　 脊髓损伤后，常因局部的抑制环境导致神经轴突不能再生。研究表明，周围神经移植可促进脊髓损伤后的轴突再生[1]，但周围神经和脊髓直径大小的不同、供体来源有限等因素限制了外周神经作为移植体的应用。周围神经的基膜成分在促进神经纤维再生中起很重要的作用。骨骼肌因具有与神经相似的基膜结构，可作为神经的良好移植替代品[2]，但新鲜骨骼肌的移植可能会产生较强的免疫排斥反应。去细胞技术可去除骨骼肌细胞，有效消除骨骼肌作为移植体的抗原性，保留基膜成分，使这种移植成为可能。

　　去细胞肌肉组织工程支架按制作方法大体可分为2种：冻融去细胞肌肉组织工程支架(freezethawed acellular muscle graft， FAMG)和化学去细胞肌肉组织工程支架(chemically extracted acellular muscle graft， CEAMG)。已有文献报道冻融去细胞组织工程支架用于脊髓损伤治疗的研究，但效果不佳[3]，而化学去细胞肌肉组织工程支架对脊髓损伤的作用目前还不清楚。本实验利用化学去细胞方法去除骨骼肌的细胞成分，把化学去细胞骨骼肌支架移植入大鼠脊髓损伤处，观察化学去细胞肌肉促进脊髓轴突再生的效果，同时与新鲜肌肉和冻融去细胞肌肉支架进行比较。

1 材料与方法

　　1.1 实验动物 Wistar大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。

　　1.2 实验设计 24只大鼠随机分成4组，制成脊髓半横断损伤模型后植入移植物或不做处理。A组，脊髓缺损处植入化学去细胞肌肉支架；B组，脊髓缺损处植入冻融去细胞肌肉支架；C组，脊髓缺损处植入从正常大鼠取出的新鲜肌肉；D组，空白组，脊髓缺损处不做处理。术后4周，银染观察脊髓轴突的再生情况，并用锇酸染色鉴定化学去细胞肌肉支架中的有髓神经纤维。另取6只化学去细胞肌肉治疗的模型鼠分别行HRP顺行和逆行示踪以观察再生轴突的来源。

　　1.3 化学去细胞肌肉支架的制备 参考BROWN等[4]去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架。简述如下：取Wistar大鼠腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37℃、50r/min摇48h后，转入30mL/L的TritonX100溶液，摇床中37℃、50r/min摇48h。然后放入蒸馏水中，摇床37℃ 50r/min摇48h。换成10g/L的SDS溶液，摇床37℃，50r/min摇48h。PBS洗24h。PBS中4℃保存备用。取部分支架纵切面冰冻切片，HE染色观察细胞是否去除干净。

　　1.4 冻融去细胞肌肉支架的制备 取Wistar大鼠椎旁肌。按下述程序处理：在30g/L的NaCl溶液中浸泡10min，放入液氮至温度平衡；在蒸馏水中浸泡融化复温，再放入液氮中至温度平衡后取出，在等渗盐水中融化复温，反复3次。轻轻挤压肌条，漂洗，PBS中4℃保存备用。纵切面切片，HE染色观察支架的组织结构。

　　1.5 脊髓半横断损伤模型的制备及生物支架移植 成年雄性Wistar大鼠，用100g/L水合氯醛麻醉，取背后正中切口，剪开皮肤，钝性分离肌肉，暴露椎骨，行椎板切除术，暴露T10的脊髓，用虹膜剪的一侧在脊髓正中垂直插入直到透过脊髓，然后用剪刀剪下一段2mm的右半侧脊髓，于缺口处植入移植物，在移植物上方压一硅胶片以固定移植物，空白组损伤处不做任何处理，之后逐层封闭伤口。术后应用抗生素1周。

　　1.6 Holmes镀银染色法显示脊髓移植区轴突再生情况 术后4周，将模型鼠用100g/L水合氯醛麻醉，40g/L的多聚甲醛心脏灌流固定。取出含移植物部分或损伤处的脊髓，40g/L多聚甲醛4℃浸润固定，梯度蔗糖脱水，OCT冷冻包埋。恒冷箱切片机以冠状面切片，16μm厚。按Holmes镀银染色法染色显示再生的轴突。

　　1.7 锇酸染色鉴定化学去细胞肌肉支架中的有髓神经纤维 取A组切片，入10g/L火棉胶液1min，取出至微干，再入800mL/L乙醇硬化1～2min，充分水洗。滴加10g/L锇酸水溶液足量覆盖切片，放在有盖暗湿盒内，置微波5档3min，取出后复温至室温，蒸馏水洗3次；梯度乙醇脱水、透明、树胶封固。

　　1.8 HRP示踪鉴定化学去细胞肌肉支架中的再生轴突的来源 为进一步验证化学去细胞支架中再生的轴突是否来源于脊髓，另采用6只模型鼠移植入化学去细胞肌肉支架后，分2组分别进行HRP顺行和逆行示踪。具体过程如下，用上述方法制备脊髓损伤模型后，移植化学去细胞支架，然后分别在移植处上方或下方0.5cm处用微量注射器注入300g/L的HRP 2μL。7d后按1.6方法取材，冰冻切片，DAB显色，蒸馏水洗，梯度乙醇脱水、透明、树胶封固。

　　1.9 图像处理与统计学分析 按STOKOLS等[5]的方法，每只动物随机取2张切片，400倍镜下观察，从移植物头端、中部及尾端三个区域内各取两点，对移植物中的再生轴突计数并求和，作为这张切片的再生轴突数，两张切片的再生轴突数求平均值作为此动物的再生轴突数，每组6只动物间取平均值作为该组再生轴突数量值，实验结果以±s表示。各治疗组再生轴突数量采用SSPS11.5统计软件处理，各组均数的比较采用单因素方差分析(Oneway ANOVA)，有显著差异的组间分别采用t检验进行进一步验证。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　　果

　　2.1 化学与冻融去细胞肌肉支架的组织结构 HE染色观察可见化学去细胞肌肉支架中骨骼肌细胞成分消失，而纤维网架结构保持完整，支架内主要为平行管道(图1)。冻融去细胞肌肉支架切片中可见骨骼肌细胞成分依然存在，但是肌细胞完整性受到破坏，细胞横纹消失，肌细胞间出现与骨骼肌长轴平行的空隙(图2)。

　　2.2 化学去细胞肌肉支架有效促进了损伤脊髓的轴突再生 移植术后4周，A组切片可见移植物中有大量宿主细胞，银染显示有大量轴突(613.17±154.96)成束长入移植物。再生的轴突规则排列相互平行并与移植物和脊髓长轴平行(图3)。B组切片可见移植物支架中有少量宿主细胞，也有与移植物长轴平行的再生轴突(44.42±5.77)长入支架，但数量明显少于A组(P<0.01)，而且再生轴突多单独走行(图4)。C组与B组相似，切片可见较多宿主细胞迁入到移植物中，少量单独走行的轴突(78.08±34.21)进入到支架中，再生轴突的数量明显少于A组(P<0.01)，与B组相近(P>0.05)(图5)。D组切片可见损伤处成一大的空洞或有少量结缔组织侵入，但侵入的结缔组织与脊髓断端有大的空隙，无再生轴突穿过脊髓损伤区(图6)。

　　2.3 化学去细胞肌肉支架中再生的有髓神经纤维鉴定 锇酸染色显示A组移植物中有少量的有髓神经纤维。有髓神经纤维的数量明显少于银染结果中的再生轴突的数量(图7)。

　　2.4 化学去细胞肌肉支架中再生轴突的来源 化学去细胞肌肉支架移植后1周HRP顺行和逆行示踪结果显示移植物中有HRP阳性轴突分布，这表明损伤脊髓的头端和尾端的轴突均可长入化学去细胞肌肉支架中(图8、图9)。

　　3 讨　　论

　　去细胞肌肉应用在脊髓损伤的治疗有诸多优点。首先，同其他移植物类似，去细胞肌肉移植代替了损伤脊髓组织对神经元轴突再生的抑制环境，而为脊髓神经纤维的再生提供了一个有利的环境；其次，骨骼肌的细胞外基质成分如层黏连蛋白(laminin)、Ⅳ型胶原(type Ⅳ collagen proteins)等，可促进神经轴突再生，冻融去细胞肌肉可自然保留这些成分，而且这些成分也可以在化学去细胞后保留在支架中发挥促进神经轴突再生的作用[6]。肌纤维的排列结构与神经纤维类似，即使化学试剂完全去除细胞后，由细胞外基质形成的相互平行的管道样结构仍然保留，它们既提供了神经轴突可生长穿过的足够空间，又为再生神经轴突提供有方向的支持和引导，这对损伤脊髓的功能恢复具有重大意义。从本实验的结果看，三组移植物中都可见再生的轴突，这反映了细胞外基质对轴突再生的作用，而再生的轴突是有组织和有方向的，表明了去细胞肌肉支架作为神经组织工程支架而具有的天然优势。

　　本研究中发现化学去细胞肌肉支架与新鲜肌肉和冻融去细胞肌肉支架相比，可更好促进损伤脊髓的神经轴突再生。这说明化学去细胞肌肉支架除具有上述促进神经轴突再生的机制外，可能还包括其他更重要的因素。化学去细胞支架与其他两组支架的最大区别在于其细胞成分已完全去除，仅保留细胞外基质所构成的孔道结构，这样一方面会更好的暴露了层黏连蛋白、Ⅳ型胶原等有效成分，另一方面为轴突再生提供接触引导作用而促进其再生[7]，并不产生轴突再生的阻力。此外，这种结构特点使其具有良好的通透性，利于细胞成分快速进入。本研究观察到在损伤后3d化学去细胞肌肉支架中即可见到大量宿主细胞，在移植术后4周，可见化学去细胞肌肉支架中的宿主细胞成分明显多于其他两组，而脊髓损伤后再生的细胞成分有很多是对神经轴突再生有促进作用的，比如巨噬细胞[8]，实验中我们已观察到化学去细胞支架中有巨噬细胞(本文结果未显示)。进入到化学去细胞肌肉支架中的这些细胞成分可使脊髓中损伤和再生之间的动态平衡向再生方向移动，促进脊髓轴突长入支架。这些因素的存在可能导致了A组与其他两组移植物的巨大差异。

　　除轴突再生外，脊髓损伤修复的另一个重要方面就是髓鞘的修复。为此，本研究用锇酸染色鉴定化学去细胞肌肉支架中的髓鞘生成情况。结果显示，部分再生的神经轴突有髓鞘形成，但生成髓鞘的神经纤维很少，这可能是由于内源性少突胶质细胞的前体细胞不能充分增生和分化所导致的[9]。

　　脊髓组织工程支架中的再生神经轴突可以来自于脊髓，也可以来自于脊髓周围神经根[10]，而移植物能促进脊髓的神经轴突再生(而不是促进神经根所代表的周围神经的再生)，相对来说是更重要的，只有这样才有可能重建脊髓神经传导通路，恢复脊髓的功能。因此本实验用HRP示踪技术验证化学去细胞肌肉支架对脊髓上行和下行神经轴突再生的促进作用。HRP示踪结果显示化学去细胞支架移植后1周，支架中可见上行和下行的HRP阳性神经轴突，这与银染的结果一致。化学去细胞肌肉移植后1个月，可见移植物头尾两端均有神经轴突长入。这表明化学去细胞肌肉支架中的再生神经轴突来源于脊髓。

　　综上所述，化学去细胞肌肉支架可有效促进脊髓的神经轴突再生，而且再生的神经轴突是高度规则排列和有方向的。该支架有望成为一种神经组织工程材料，用于脊髓损伤的治疗。

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