糖尿病大鼠视网膜中VEGF经由PKC/NO上调ICAM1表达的机制探讨

　　　　　　作者：张小玲，丁延宁，朱媛，文亮

【摘要】 目的 探讨在糖尿病大鼠的视网膜组织中，视网膜血管内皮生长因子 (VEGF)通过激活蛋白激酶C(PKC)，上调一氧化氮(NO)含量，促使细胞间黏附因子1(ICAM1)升高的信号机制。方法 腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型。设立正常组、糖尿病组、糖尿病大鼠PKC抑制剂组、二甲基亚砜对照组。应用硝酸还原酶法检测视网膜组织中NO含量，应用Westernblot检测VEGF及ICAM1蛋白含量。结果 在糖尿病大鼠视网膜中VEGF、NO含量较正常大鼠明显升高(P<0.05)。应用PKC抑制剂24h，视网膜组织中VEGF、NO含量明显下降，与二甲基亚砜对照组相比有显著差异(P<0.05)。 ICAM1含量也呈现出相应的变化趋势，糖尿病大鼠视网膜中的ICAM1较正常大鼠显著增高(P<0.01)。而应用PKC抑制剂24h，ICAM1的表达明显低于二甲基亚砜对照组(P<0.01)。VEGF、NO、ICAM1的含量在二甲基亚砜对照组与糖尿病组之间的差异无统计学意义。结论 链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠视网膜病变中ICAM1蛋白表达升高，可能是通过VEGF/PKC/NO这一信号通路完成的。

【关键词】 糖尿病；视网膜；血管内皮生长因子；蛋白激酶C；一氧化氮；细胞间黏附分子1

　　ABSTRACT: Objective To investigate how vascular endothelial growth factor (VEGF) upregulates intercellular adhesion molecule1 via protein kinase C (PKC)/ nitric oxide (NO) pathway in the retina of diabetic rats. Methods All the rats were pided into 4 groups: normal， diabetes， diabetes+PKCI and control groups. Diabetes was induced by an intraperitoneal injection of STZ. PKC inhibitor GF109203X was injected intravitreally after 5 months of streptozotocin induced diabetes. NO was determined by nitrate reductase method. VEGF and intercellular adhesion molecule1 (ICAM1) were measured by Western blot. Results VEGF and NO expressions increased obviously in the retina of diabetic rats compared with those in the normal group (P<0.05). So was ICAM1 expression (P<0.01). VEGF and NO expressions decreased significantly 24 hours after GF109203X was injected compared with those in the control group (P<0.05). So was ICAM1 expression (P<0.01). However， no significant differences were found in VEGF， NO or ICAM1 expressions between the diabetic group and the control group. Conclusion The results suggest that ICAM1 might be upregulated by VEGF via PKC/NO pathway in diabetic retinopathy in rats.

　　KEY WORDS: diabetes; retina; vascular endothelial growth factor (VEGF); protein kinase C; nitric oxide; intercellular adhesion molecule1 (ICAM1)

　 糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy， DR)典型的病理改变特征是视网膜血视网膜屏障(bloodretina barrier， BRB)破坏和新生血管形成。白细胞在视网膜血管内异常地聚集，并与血管内皮细胞黏附是引起血BRB破坏的重要因素。这一异常过程是在细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule1， ICAM1)的介导下完成的[1]。目前，在DR中，ICAM1增高的机制尚未完全明了。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)是一种糖蛋白，其受体属于酪氨酸蛋白激酶家族成员，位于细胞质膜上，为催化型受体。当VEGF与其受体结合后，受体发生二聚化并被激活，进而引起下游分子的活化[2]。RADISAVLJEVIC等[3]在研究脑微血管病变时发现，VEGF可经磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinsitol 3 OHkinase， PI3K)/AKT/一氧化氮(nitric oxide， NO)途径上调ICAM1。VEGF可以活化蛋白激酶C(protein kinase C， PKC)，而PKC在糖尿病视网膜病变时对视网膜组织内的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase， NOS)起重要的调节作用已被研究证实，然而，糖尿病视网膜病变时ICAM1的上调是否有可能经VEGF/PKC/NO信号途径，目前国内外尚未见研究报道。本研究拟对VEGF/PKC/NO信号通路进行初步的探讨，进一步阐明DR发生发展的机制，为DR的预防和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

　　1.1 动物模型与分组 选用体重为350～400g，健康的雄性SpragueDawley大鼠46只，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。根据随机数字表法，选出6只大鼠作为正常组(normal，N)，其余40只为糖尿病实验组。实验组大鼠禁食12h，应用链脲佐菌素按60mg/kg体重腹腔注射。STZ溶于pH 4.5、10mmol/L柠檬酸柠檬酸钠缓冲液中，用时配制。正常组大鼠腹腔注射柠檬酸柠檬酸钠缓冲液。注射后72h尾尖取血，血糖仪(强生稳豪One touch)测血糖浓度，血糖浓度≥16.7mmol/L时，视为糖尿病大鼠模型建立。将糖尿病大鼠置于22～24℃ 环境中，每12h光照昼夜循环，食水不限，垫料每日清晨更换。在饲养期间，每月测血糖、体重，将血糖回退鼠剔除出组。糖尿病成模5个月后，将糖尿病大鼠随机分成3组：糖尿病组7只(diabetes)、糖尿病二甲基亚砜对照组6只(control)、PKC抑制剂注射组7只(PKC inhibitor)。将正常组和糖尿病组的大鼠腹腔注射过量水合氯醛处死。PKC抑制剂GF109203X(Calbiochem公司)溶解于10g/L的二甲基亚砜溶液，配制成10-5mol/L的溶液，取10μL 注射入PKC抑制剂组大鼠玻璃体腔。糖尿病二甲基亚砜对照组大鼠注射10g/L的二甲基亚砜溶液10μL作为PKC抑制剂组的对照。注射方法为：100g/L水合氯醛5mL/kg麻醉大鼠，用高压消毒微量进样器，显微镜下玻璃体腔注射，注射中发生白内障及眼内出血者除去。注射后24h水合氯醛过量麻醉处死两组大鼠。

　　1.2 NO含量的检测 将视网膜组织在冰生理盐水中漂洗后称重，每一张视网膜大约为0.084g。随后将视网膜组织放入1mL的玻璃匀浆器中，加入预冷的生理盐水756μL，研磨粉碎，使组织匀浆化，4℃离心10min(2000r/min)，取上清备用。紫外分光光度法测定总蛋白含量。一氧化氮试剂盒(硝酸还原酶法)测定NO含量。

　　1.3 VEGF和 ICAM1的检测 将分离出的视网膜组织置入1mL的玻璃匀浆器中，每张视网膜加入含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的组织细胞裂解液(北京博奥森生物技术有限公司)200μL冰上充分研磨，4℃离心10min(2000r/min)，取上清测蛋白浓度，Westernblot检测VEGF、ICAM1和βactin的表达。

　　蛋白提取物用SDSPAGE胶分离。待溴酚兰跑到胶底部时停止电泳。将分离好的蛋白从凝胶转移到PVDF膜上，半干法2.5h。用含有吐温20的TBS溶液配制的50g/L脱脂奶粉溶液，37℃封闭1h。分别用1∶200兔抗大鼠ICAM1多克隆抗体(Santa Cruz USA)、1∶200兔抗大鼠VEGF多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)、1∶500兔源βactin抗体(北京博奥森生物技术有限公司)4℃孵育过夜。TBST洗膜，10min×3次，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)37℃孵育2h。孵育完毕后TBST洗膜，10min×3次，化学发光(PIERCE)，柯达底片曝光，用BIORAD的凝胶成像系统照相，QUANTITY ONE软件进行光密度分析。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行数据处理。所有数据以均数±标准差(±s)表示，测定NO含量时分别测定3个平行样品并取平均值，组间比较用oneway ANOVA检验，多重比较用LSD检验，检验水准α取0.05。

2 结　　果

　　2.1 血糖及体重的变化 实验大鼠饲养期间，平均每个月测体重、血糖各1次。正常组大鼠生长正常，糖尿病大鼠体重不断减轻，处死前大鼠体重、血糖情况见表1。表1 各实验组大鼠血糖、体重的变化

　　2.2 NO含量 糖尿病病程5个月时，糖尿病组大鼠视网膜内NO含量(21.68±3.06)明显高于正常组(10.94±4.60) (P=0.003，图1)。糖尿病二甲基亚砜对照组(21.14±3.56)与糖尿病组(21.68±3.06)相比，NO含量无明显差异。PKC抑制剂组中NO含量(13.82±4.60)与二甲基亚砜对照组(21.14±3.56)相比，差异有统计学意义(P=0.024，图1)。

　　2.3 VEGF含量 与正常组相比，糖尿病组视网膜组织中VEGF含量明显增高(P=0.004)，PKC抑制剂组与二甲基亚砜对照组相比，VEGF含量明显降低(P<0.001，图2)。

　　2.4 ICAM1含量 糖尿病组大鼠视网膜中ICAM1蛋白表达增高(与正常组比较，P<0.01)。PKC抑制剂组ICAM1表达显著降低(与二甲基亚砜对照组比较，P<0.01，图3)。

　　3 讨　　论

　　DR是糖尿病最为常见且最严重的微血管并发症之一，是导致20～74岁成年人致盲的最常见原因[4]。预计到2030年，美国将有2500万、全球将有3亿DR患者[5]。 DR的主要病理特征是血视网膜屏障破坏和视网膜新生血管形成，其发病机制复杂，是众多因素综合作用的结果。

　　在糖尿病性视网膜病变发生发展中，血视网膜屏障的破坏被认为与白细胞的异常黏附、浸润有密切的关系。在链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病模型早期，视网膜微循环中的白细胞密度显著增加。糖尿病大鼠视网膜微动脉、微静脉和毛细血管内的白细胞数分别增加2.2倍、3.8倍和3.6倍[6]。而血管渗漏及无灌注与白细胞黏附及浸润相关[7]。白细胞与内皮细胞的异常黏附、浸润正是通过细胞间黏附分子介导的。ICAM1是介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互作用的糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，通过与其相应的配体即整合素相结合，形成网络，介导细胞间黏接，并相互传递信号，参与调控细胞功能，在机体的胚胎发育、炎症、免疫反应、血栓形成及肿瘤转移等过程中起关键作用。MIYAMOTO等[7]研究表明在链脲菌素诱导的大鼠糖尿病模型中，视网膜组织中异常的白细胞聚集、浸润与视网膜中高表达的ICAM1有关，而应用ICAM1抗体后可以降低白细胞的淤滞并改善视网膜微血管的渗漏。MCLEOD等[8]也验证了糖尿病患者视网膜血管中的ICAM1表达显著增高。由此认为，ICAM1的异常升高是导致DR发生发展的重要因素。

　　VEGF是一类与血管增殖有密切关系的血管内皮生长因子。在DR中，视网膜内的VEGF高表达，并与其受体结合，作为酪氨酸蛋白激酶的受体自身磷酸化，继而激活磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(phosphatidylcholine specific phospholipase C， PLC)，水解磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol diphosphate， PIP2)，产生二脂酰甘油(diacylglycerol， DAG) 和肌醇三磷酸(trisphosphate inostitol， IP3)，其中DAG可激活胞质中的PKC。同时，多项研究表明，糖尿病视网膜病变时，视网膜内的NOS活性增高与PKC的活化有关，并受PKC调节[911]。RADISAVLJEVIC等[3]在研究脑微血管病变的过程中发现，ICAM1可以经由PI3K/AKT/NO途径被VEGF上调。然而，糖尿病视网膜病变时ICAM1的升高是否可以通过VEGF/PKC/NO途径进行，作者对此进行了初步的探讨。

　　本研究选取链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型，糖尿病模型建立后饲养5个月，玻璃体腔分别注射PKC抑制剂GF109203X和二甲基亚砜溶液，24h后处死大鼠，摘取眼球，硝酸还原酶法检测视网膜组织内NO含量，应用Westernblot法检测视网膜组织中的VEGF和ICAM1蛋白含量。大鼠视网膜组织中的NO、VEGF和ICAM1含量比正常大鼠显著增高(P=0.003，P=0.004，P<0.01)。PKC抑制剂组大鼠NO、VEGF和ICAM1含量与二甲基亚砜对照组比较明显下降(P=0.024，P<0.01，P<0.01)。

　　糖尿病大鼠视网膜组织NO的含量较正常大鼠显著增高，应用PKC抑制剂后NO的含量明显降低，与KOWRULU[12]的研究结果一致。进一步验证了糖尿病模型组视网膜组织内NO是在NOS的作用下产生的，其含量异常增高，以及PKC对NOS的调节作用。

　　糖尿病大鼠视网膜组织中，VEGF含量较正常大鼠显著增高，表明VEGF是参与糖尿病视网膜病变的重要因素。应用PKC抑制剂后，VEGF表达明显降低，提示VEGF与PKC之间存在着互为因果的复杂关系，而这一结果也与BIAN等[13]的报道相一致。

　　正常大鼠视网膜组织中也有ICAM1的低表达，但在大鼠糖尿病病程5个月时，视网膜组织中的ICAM1蛋白含量明显增高。在应用了PKC抑制剂后，VEGF和NO含量均降低，而ICAM1表达也降低。

　　综上所述，在正常大鼠视网膜组织中ICAM1蛋白呈低表达，而在糖尿病大鼠视网膜组织中ICAM1蛋白表达显著升高。当应用PKC抑制剂后，视网膜组织中VEGF及NO含量明显降低，同时ICAM1蛋白表达下调。这一现象表明在糖尿病时，视网膜组织中ICAM1的上调可能与VEGF/PKC/NO途径有关。因此，VEGF/PKC/NO/ ICAM1信号传导通路在糖尿病性视网膜病变发生发展机制中可能起着重要的作用，阐明其进一步的机制将是今后研究的方向。

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