百合多糖的分离纯化及抗肿瘤作用

　　　　　　 作者：弥曼，李汾，任利君，梅其炳

【摘要】 目的 从百合粗多糖中分离纯化出纯化的百合多糖，并观察其抗肿瘤作用。方法 用水提醇沉法从植物百合中提取百合粗多糖，经透析、除蛋白、冷冻干燥后，采用DEAE阴离子交换纤维素分段洗脱对其进行分离纯化，得到纯化的百合多糖；将纯化的百合多糖用于h32荷瘤小鼠，测定其对荷瘤小鼠免疫功能的影响及抗肿瘤作用。结果 分离出了纯化的百合多糖，经纯度鉴定表明成分均一；该多糖能增强h32荷瘤小鼠的免疫功能，抑制h32肿瘤的生长。结论 纯化的百合多糖成分均一，具有抗肿瘤作用。

【关键词】 百合多糖；分离纯化；抗肿瘤作用

　　ABSTRACT: Objective To isolate and purify crude lily polysaccharide and observe antitumor activity of the isolated and purified polysaccharide. Methods Crude lily polysaccharide was extracted from lily by water extraction and ethanol precipitation. After dialyzing， deproteining and freezedrying， preliminary purification of crude lily polysaccharide was obtained. After being separated by anionexchange chromatography， preliminary purification was further isolated and purified. Purified lily polysaccharide was given to the h32bearing mice. The effects of purified lily polysaccharide on tumor weight and immune function were evaluated. Results Crude lily polysaccharide was isolated and purified successfully. After a Sephadex chromatography， the purified polysaccharide showed as a single peak， demonstrating its homogenicity. The purified lily polysaccharide showed an inhibitory effect on h32bearing mice tumor growth. It significantly increased the weight of immune organs and improved the immune function of the mice. Conclusion The purified lily polysaccharide was homogeneous. It could inhibit h32 tumor growth and enhance nonspecific immune functions in h32bearing mice. This research has laid the foundation for further pharmacological study on lily polysaccharide.

　　KEY WORDS: lily polysaccharide; isolation and purification; antitumor activity

　　百合中主要含有酚酸甘油酯、苷类、生物碱及多糖，另外还含有一些磷脂、蛋白质和无机元素。对百合保健功能的研究已开始从单纯药理研究向保健功能成分的研究转变。国外已从百合植物碱中分离得到秋水仙碱，并对其抗癌作用做了研究。另有研究表明，从百合中提取的皂苷具有止咳、平喘等功能，而作为百合中主要功能成分之一的百合多糖的组成却不是很明确。本研究从百合粗多糖中分离出百合中性多糖、百合弱酸性多糖、酸性多糖及蛋白质，并对中性多糖进行了抗肿瘤及非特异性免疫调节研究。

1 材料与方法

　　1.1 主要试剂与仪器 百合粗多糖干燥制剂(自制)；DEAE纤维素(上海生化试剂公司)；SephadexG200(上海生物工程公司)；其他试剂均为国产分析纯。大容量离心机、旋转蒸发器、烘箱、透析袋(截留分子质量8000，华美生物工程公司)；磁力搅拌器、HL2B cm数显恒流泵、梯度混合仪、SBS100自动分部收集器(上海沪西分析仪器厂)。

　　1.2 实验动物 ICR封闭群小鼠，清洁级(合格证号：陕医动字：08004)，体重18～22g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供；h32种鼠由第四军医大学实验动物中心提供。

　　1.3 方法

　　1.3.1 百合多糖的提取及分离纯化 采用水提醇沉法，得水溶性百合粗多糖。百合粗多糖经Sevag法除蛋白8次，经透析、冷冻干燥后，得到初步纯化的百合多糖。采用DEAE纤维素柱分离法[1]对冷冻干燥物进行分离纯化。取定量DEAE纤维素，用蒸馏水浸泡，再用0.5mol/L NaOH及0.5mol/L NaCl混合液处理30min，抽干后用蒸馏水洗至中性，0.5mol/L HCl溶液处理30min，抽干后用蒸馏水洗至中性。用pH 6.0磷酸盐缓冲溶液处理后，脱气装柱(2.5cm×50cm)。把冷冻干燥物溶于蒸馏水，制成0.5g/L水溶性百合多糖溶液。准确吸取该溶液2mL上样，5min后待多糖渗入DEAE纤维素后以蒸馏水洗脱，流速为0.5mL/min，每管5mL，各管用蒽酮硫酸法检测，直至无洗脱峰为止。再用0.1mol/L和0.5mol/L的NaCl溶液洗脱弱酸性多糖，最后用0.5mol/L的NaOH溶液洗脱酸性多糖及蛋白质类物质。在各过程中，均用蒽酮硫酸法检测多糖，并用紫外分光光度计在280nm处对蛋白质类物质的洗脱情况进行监测。将用蒸馏水洗脱的洗脱液按洗脱峰进行收集得纯化的百合多糖，其为百合中性多糖。

　　1.3.2 百合中性多糖的纯度测定 凝胶层析柱法[23]检验纯度。取SephadexG200凝胶柱(1.5×45)层析。使用前用0.05mol/L NaCl平衡2d，流速为5～6mL/h，取纯化的百合多糖3mg溶于最小体积的0.05mol/L NaCl中，上柱，用0.05mol/L NaCl溶液洗脱，流速8mL/h，按2mL/管分部收集，并每管以蒽酮硫酸法跟踪检测糖含量，观察洗脱峰以检验纯度。

　　1.3.3 免疫器官重量及肿瘤抑制率的测定 取接种7d的种鼠腹水癌细胞，用生理盐水制成细胞数为1×106个/mL的细胞悬液，以每鼠0.2mL接种于小鼠右腋皮下，24h后随机分为正常组、肿瘤模型对照组、不同剂量纯化百合多糖给药组[50、100、200mg/(kg·d)]及5Fu对照组，每组10只。正常组及肿瘤模型对照组用等量生理盐水灌胃，不同剂量纯化百合多糖给药组及5Fu对照组分别给予纯化百合多糖及5Fu灌胃，连续7d。第8天处死小鼠，摘取瘤块、胸腺、脾，分别按文献方法计算肿瘤抑制率、胸腺指数及脾指数[4]。

　　1.3.4 LP1小鼠巨噬细胞吞噬活性的测定 接种、分组及给药同上。各组小鼠于给药第2天、第5天分别腹腔注射5g/L可溶性淀粉25mL/kg。给药7d后，所有小鼠腹腔注射普通肉汤50mL/kg，轻揉腹部，任其活动10min。用注射器吸取腹腔液0.1mL于洁净载物玻片，加0.1mL 10mL/L鸡红细胞悬液，充分混匀，置于湿盒内37℃孵育30min。用生理盐水漂洗3次，室温干燥。按文献[5]方法计算吞噬百分率和吞噬指数。

　　1.4 统计学处理 数据采用均数±标准差(±s)表示，显著性检验采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　　果

　　2.1 DEAE纤维素柱层析分离纯化

　　2.1.1 蒸馏水洗脱中性多糖 用蒸馏水洗脱的部分在280nm处几乎无吸收，在620nm处出现吸收峰，说明用蒸馏水洗脱的部分为不含蛋白质类物质的中性多糖。在620nm处出现的1个糖峰有可能分别代表多种多糖组分，但是否是纯多糖，还需近一步鉴定。按洗脱峰收集7～9管的洗脱液，合并后得到百合中性多糖(图1)。

　　2.1.2 0.1mol/L NaCl溶液洗脱少量蛋白物质 用0.1mol/L NaCl洗脱的部分在280nm处有一小的吸收峰，在620nm处无糖峰，说明用NaCl溶液梯度洗脱出的是少量蛋白类物质(图2)。

　　2.1.3 0.5mol/L NaCl溶液洗脱弱酸性多糖 用0.5mol/L NaCl洗脱的部分在280nm处有3个吸收峰，在620nm处有4个小的糖峰，出现的位置有重叠也有独立的峰。说明0.5mol/L NaCl洗脱下来的有弱酸性多糖及蛋白质或糖蛋白(图3)。

　　2.1.4 0.5mol/L NaOH洗脱酸性多糖及蛋白类物质 用NaOH溶液洗脱的部分在280nm处有蛋白质峰，在620nm处有糖峰。糖峰和蛋白峰的出峰位置不同，说明用NaOH溶液洗脱的部分是多糖及蛋白类物质，但是量均很少(图4)。

　　2.2 百合中性多糖的纯度鉴定 SephadexG200凝胶层析柱子用0.05mol/L NaCl平衡后，将收集的百合中性多糖溶液上柱，然后用0.05mol/L NaCl洗脱，用蒽酮硫酸法对洗脱情况进行跟踪测试。结果显示，洗脱峰是单一对称的，表明了其均一性(图5)。

　　2.3 纯化百合多糖的抗肿瘤作用

　　2.3.1 纯化百合多糖对h32小鼠的抑瘤作用及对免疫器官重量的影响 实验结果表明，纯化百合多糖对宿主生存和体重均无明显影响，对小鼠h32的生长有抑制作用。给药各组瘤重与模型组瘤重比较均有显著差异(P<0.05，P<0.01)。纯化百合多糖可显著增加小鼠的胸腺重量，脾脏重量也有增加。多糖组与5Fu组相比，肿瘤抑制率虽要差，但对免疫器官的刺激要强，能显著增加他们的重量；5Fu虽有很强的肿瘤抑制作用，但对免疫系统的抑制太强，毒副作用太大。如能两者合用，既可以增强抗肿瘤作用，又可以减少毒副作用(图6)。

　　2.3.2 纯化百合多糖对h32小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 纯化百合多糖各给药组腹腔巨噬细胞吞噬率及吞噬指数明显高于肿瘤模型组(P<0.01)，说明纯化百合多糖具有非特异性免疫调节作用(图7、图8)。

　　3 讨　　论

　　本研究选用DEAE纤维素为离子交换介质，用不同的洗脱剂来纯化百合多糖的工艺是合理有效的。它在对各类多糖进行分离的同时，吸附大部分色素和一些蛋白类物质，这对百合中性多糖的纯化有利。DEAE纤维素是阴离子交换剂，在pH6.0时中性多糖不被吸附，可用蒸馏水洗脱下来；而酸性多糖易被吸附，且酸性基团越多，吸附能力越强，用不同离子强度的NaCl溶液可将酸性多糖从阴离子交换柱上逐步洗脱下来；蛋白类物质则可用NaOH来洗脱[6]。根据上述洗脱结果可知，百合粗多糖中既有中性多糖又有弱酸性多糖和酸性多糖，还可能有糖蛋白和微量的蛋白类物质[7]。在本研究中，百合中性多糖具有明显的抗肿瘤作用，这与很多中药多糖的纯化物的抗肿瘤作用是一致的[8]。分离得到的其他弱酸性及酸性多糖的药理作用还有待进一步研究[910] 。纯化后的中性百合多糖有抑制h32小鼠肝癌生长的作用，同时能提高荷瘤小鼠免疫器官的重量。免疫调节是目前公认的多糖抗肿瘤作用的主要机制之一。多糖作为一种免疫调节剂，通过多种机制刺激免疫细胞提高免疫功能，从而发挥抗肿瘤的作用[11]。有研究发现，人参多糖能增加与巨噬细胞相关的免疫复合物的活性，增强巨噬细胞的吞噬能力，并诱导机体效应细胞白介素1、白介素2等的表达，增强淋巴因子激活的杀伤细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞的活性，具有非特异性抗肿瘤作用。纯化百合多糖能明显提高h32小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，有可能是该纯化多糖含有beta(1，3)Dglucan结构，其特异性受体主要分布于巨噬细胞表面[12]。还有研究表明，猪苓多糖、茯苓多糖的抗肿瘤作用是通过影响肿瘤细胞的分裂、增殖、生长等多个环节实现的[13]。本研究从百合粗多糖中分离出8000以上分子质量的多种百合多糖组分，小分子质量百合多糖组分仍需研究。

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