外排系统与膜通透性的改变对淋球菌高水平多重耐药的影响

　　　　 作者：王冬梅，王勇，夏忠弟，田峰，邹明祥

【摘要】 　　目的 探讨外排系统与膜通透性的改变对淋球菌多重耐药的影响。方法 PCR扩增淋球菌mtrR启动子区域包含13bp回文序列在内的157个碱基片段并进行DNA测序分析；提取外膜蛋白，利用SDSPAGE进行组成型的分析。结果 5株敏感株的mtrR启动子区域未发生突变，3株高水平多重耐药株的mtrR启动子区域13bp回文序列均发生了单个A/T碱基的缺失，且均存在外膜孔蛋白表达的缺失。结论 mtrR启动子区域13bp回文序列单个A/T碱基的缺失引起的mtrCDE外排泵表达增加与外膜孔蛋白表达的缺失或下降导致的膜通透性降低，在介导淋球菌产生高水平多重耐药中起一定的作用。

【关键词】 淋球菌 多重耐药 mtr 孔蛋白

　　ABSTRACT: Objective To investigate the impact of functional enhancement of efflux pump system and reduced permeability of outer membrane on highlevel multiple resistant Neisseria gonorrhoeae. Methods Several highlevel multiple resistant isolates with erythromycin MIC=128.0mg/L， accompanied by concurrent resistance to several antimicrobial agents， were selected. 13bp inverted sequence positioned within the mtrR promoter region were amplified by PCR and directly sequenced to detect the possible gene change. The outer membrane proteins of the strains were extracted to analyze the constitutive profiles by SDSPAGE. Results There were no gene mutations in 5 sensitive strains. All the 3 highlevel multiple resistant strains contained the same mutation and exhibited a single A/T base pair deletion in 13bp inverted sequence positioned within the mtrR promoter region. Meanwhile porin protein 31ku deficiency was found in all the 3 resistant strains. Conclusion The functional enhancement of efflux pump system induced by a single A/T base pair deletion in 13bp inverted sequence positioned within the mtrR promoter region and the decreased cell envelope permeability induced by the absence of porin protein may have some effect on mediating highlevel multiple resistance in Neisseria gonorrhoeae.

　　KEY WORDS: N.gonorrhoeae; multipledrug resistance; mtr; porin protein

　　近年来，淋球菌多重耐药现象日益严重，且呈现出由低水平向高水平耐药发展的趋势。为探讨淋球菌高水平多重耐药的机制，本实验从58株临床菌株中筛选出了3株对红霉素高度耐药且同时耐多种药物(红霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、壮观霉素、头孢美唑)的菌株，针对这3株高水平多重耐药株，分别对其多重耐药调节基因mtrR启动子区域和其外膜蛋白进行了研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 菌种

　　野生型淋球菌标准株ATCC19424为香港中文大学医学院微生物系惠赠。58株临床分离菌来自中南大学湘雅医院检验科，其中5株(Ng06、Ng08、Ng19、Ng24、Ng37)对5种抗生素均敏感，3株(Ng15、Ng17、Ng21)高水平多重耐药株中，Ng21对5种抗生素均耐受，Ng15和Ng17对4种抗生素耐受，3株菌对红霉素耐受且最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration， MIC)均为128.0mg/L。

　　1.2 主要试剂

　　dNTP、pfu高保真酶、月桂酰基肌氨酸钠购自上海生物工程技术服务公司，丙稀酰胺为BBI公司进口分装，甲叉双丙稀酰胺购自英国Aldrich公司。

　　1.3 PCR扩增及产物测序

　　①模板DNA的制备：取培养24～36h的淋球菌菌落20～30个于30μL双蒸水中，煮沸10min，2000r/min离心8～10min，取上清液做模板。②PCR反应条件：引物参照文献[1]设计的序列，由大连宝生物公司合成。上游引物：5′GCTTTGATACCCGAATGTTCG3′，下游引物：5′CGTTTCGGGTCGGTTTGACG3′。扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性60s，55℃退火45s，72℃延伸60s，最后72℃延伸6min，共32个循环。③PCR产物测序分析：由上海博亚生物技术开发公司完成。

　　1.4 外膜蛋白组成型的分析

　　①外膜蛋白的提取和分离：参见文献[2]。②十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)：制备40g/L浓缩胶和120g/L分离胶，电泳：取10μL(约10μg)蛋白＋3×SDS buffer 5μL混匀，煮沸3～5min后上样，14mA电泳1h左右，待指示剂电泳至合适的位置后停止电泳，染色、脱色后照相进行凝胶扫描图像分析。

　　2 结 果

　　2.1 PCR扩增结果及测序分析

　　58株细菌和ATCC19424均能扩增出mtrR157，PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳后均呈现一条清晰的特异性带，大小与DNA标记比较，位置相符(图1)。野生型标准株ATCC19424序列与GenBank提供的序列完全一致(图2)。58株临床株中有12株发生了碱基突变，突变为mtrR启动子区域13bp回文序列5′AAAAAGTCTTTTT3′的5′端一个T/A碱基的缺失。突变菌株中对两种抗生素耐药的有2株，对3种、4种和5种抗生素耐药的株菌分别是7株、2株和1株，12株的红霉素MIC值均大于或等于32.0mg/L(图3)。

　　2.2 外膜蛋白组成型的分析

　　抽提细菌外膜蛋白，利用SDSPAGE测定外膜孔蛋白的表达。58株淋球菌中有4株存在31ku外膜孔蛋白的缺失，其中3株为高水平多重耐药株，且红霉素MIC为128.0mg/L，另外1株菌只对1种抗生素耐受，其红霉素MIC为2.0mg/L(图4)。

　　3 讨 论

　　淋球菌产生耐药的原因除由质粒介导产生的β内酰胺酶外，主要是通过膜蛋白机制及膜通透性改变而产生耐药性[1]。抗生素进入细菌时是经由特异性孔通道蛋白由高浓度向低浓度弥散，一旦孔蛋白发生缺失或变异，抗生素进入细菌的量就会减少，易产生耐药现象[3]。淋球菌外膜上第一类蛋白(protein Ⅰ， PⅠ)被称为淋球菌主要外膜蛋白，在功能上相当于孔蛋白，相对分子量介于30～43ku，主要包括3种，大小分别为31、33、35ku。本研究抽提细菌外膜蛋白，利用SDSPAGE测定外膜孔蛋白的表达。58株淋球菌中有4株存在31ku外膜孔蛋白的缺失，其中3株为高水平多重耐药株，红霉素的MIC均等于128.0mg/L；另外1株只对1种抗生素耐受。据此，推测31ku蛋白可能参与了淋球菌的多重耐药，31ku蛋白缺失引起的膜通透性降低，导致抗生素进入细菌的量减少，进而引起耐药。本研究中58株淋球菌未发现有35ku蛋白的缺失，35ku蛋白作为淋球菌外膜的主要成分，一旦发生缺失将危及淋球菌自身的生存，所以35ku蛋白可能并不参与淋球菌多重耐药或者不是以缺失的形式来参与。国内有学者报道[4]淋球菌外膜33ku蛋白与环丙沙星耐药关系密切，参与淋球菌对氟喹诺酮类药物的耐药。本研究58株临床分离株中对氧氟沙星、诺氟沙星耐药的淋球菌未发现有33ku蛋白的缺失，这可能与样本数较少有关。33ku蛋白是否参与淋球菌多重耐药，尚没有确切的实验依据。

　　单独的膜通透性改变只能介导淋球菌产生低水平或中等水平的耐受，因为膜通透性的降低仅能延缓细菌胞内抗生素达到稳态的时间，并不能显著降低抗生素的稳态浓度。因此，筛选出的3株高耐株应该还存在着其他耐药机制。
　　
　　目前，淋球菌多重耐药的产生倾向于主动外排机制为主要原因。Mtr系统是人们最早关注也是研究最为深入的主动外排系统。Mtr系统是能量依赖的细胞膜外排泵，由mtrR调控基因、mtrCDE结构基因组成的一个操纵子调控的。新近研究发现，在mtrCDE的下游有一个被命名为mtrF的新基因，参与淋球菌高水平耐药[5]。Mtr系统对淋球菌多重耐药的调节机制在转录水平上分为两种：一种是mtrR依赖调节[6]；另一种是非mtrR依赖调节，在mtrR调控基因和结构基因之间有一段250bp的片段，其中包含了mtrR启动区13bp插入重复序列。该序列碱基发生突变，将引起mtrR阻遏蛋白合成减少或作用减弱，mtr操纵子的转录加强，使得mtrCDE基因的表达增加，淋球菌细胞膜外排泵蛋白作用增强，从而提高对抗生素的耐受性[7]。这种由于mtrR启动子区域中回文序列基因突变引起mtrR阻遏蛋白被抑制，从而引起淋球菌对抗生素的耐受水平明显高于由于mtrR编码基因发生突变引起的耐受水平。国外文献报道，mtrR启动子区域中13bp回文序列2个TT碱基的插入可以介导淋球菌产生高水平耐受[8]。NG[9]和COUSIN等[10]学者先后分离出mtrR启动子13bp回文序列发生单个T碱基插入的淋球菌。本研究扩增mtrR启动子区域包含13bp回文序列在内的157个碱基片段并进行DNA测序，58株有12株发生了碱基突变，且突变类型一致，均在mtrR启动子区域13bp回文序列5′AAAAAGTCTTTTT3′的5′端发生了一个T/A碱基的缺失，突变类型与某些国外报道一致[79，11]。我们没有发现13bp回文序列其他位点的突变，这可能与地域以及研究的样本数较少有关。本实验中的58株细菌，对2种以上抗生素耐药的细菌均可以检测到mtrR启动子区域中回文序列基因的突变。所以，在一定程度上认为mtrR启动子区域中回文序列基因的突变和淋球菌多重耐药性具有密切的相关性。
　　
　　在本研究中，3株高水平耐药菌的红霉素MIC显著高于其他9株回文序列单个碱基缺失但不存在膜变化的耐药菌。虽然，单独的膜通透性改变只能介导淋球菌产生低水平或中等水平的耐受，但是如果与其他耐药机制联合，将“放大”各自独立作用的效力，产生有效的叠加效应，使淋球菌呈现出高水平耐药。这3株高耐菌13bp回文序列单个碱基缺失引起的mtrCDE外排泵过度表达与孔蛋白缺失介导的膜通透性降低协同作用，对抗生素有效的泵出与流入能力的减弱形成强有力的联合，从而使得这3株淋球菌耐药水平高于其他9株菌。淋球菌高水平多重耐药是个多因素多机制共同参与和作用的结果，其中膜介导的耐药机制，无论是外膜通透性的改变还是内膜泵蛋白功能的增强都是一个复杂而有效的过程，有待于进一步的研究和探索。

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