用血管内皮细胞膜色谱模型研究9种药物的生物亲和作用

　　　　 作者：张典，袁秉祥，邓秀玲，杨广德，贺浪冲

【摘要】 　　目的 增加细胞膜色谱法的适用范围，构建血管内皮细胞细胞膜固定相，研究药物与血管内皮细胞膜上受体的生物亲和作用。方法 培养血管内皮细胞细胞株，制备细胞膜固定相，应用细胞膜色谱法研究九种药物与受体的亲和力。结果 九种不同的配体与受体的亲和顺序为：S(+)QNB、哌唑嗪、R(-)QNB、阿托品、育亨宾、BMY7378、(±)美托洛尔、山莨菪碱、东莨菪碱。其容量因子分别为：14.289、13.667、11.121、6.794、4.758、4.386、3.926、2.424、2.412。结论 血管内皮细胞膜色谱模型具有高度稳定性，可试用于药物的高效初筛。

【关键词】 细胞膜 色谱 血管内皮细胞

　　ABSTRACT: Objective To extend the application of cell membrane chromatography (CMC)， the cell membrane stationary phase (CMSP) with human umbilical vein endothelial cell (EVC304) are constructed. The chromatography affinity of drugs to receptors of EVC304 is investigated. Methods We cultured EVC304 strain and constructed EVC304 CMSP. The bioaffinity of nine drugs to receptors was investigated per CMC method. Results The affinity rank order of receptors obtained from CMC for the nine ligands was as follows: S(+)QNB， prazosion， R(-)QNB， atropine， yohimbine， BMY7378， metoprolol， 6542， and scopolamine. The related kvalues were 14.289， 13.667， 11.121， 6.794， 4.758， 4.386， 3.926， 2.424， and 2.412. Conclusion The EVC304 expressed CMSP has high stability and can be used to speed up the initial screening.

　　KEY WORDS: cell membrane; chromatography; vascular endothelial cell

　　细胞膜色谱法(cell membrane chromatography， CMC)是以固定在硅胶表面的细胞膜为固定相，通过药物在固定相上的色谱行为有效地将药物的体内过程在体外进行模拟[13]。此法已被证明可用于研究药物与受体的相互作用和中草药中生物活性成分的筛选[46]。但是，用CMC法研究受体和筛选药物时，有时所需标本量太少并难以收集，还不能进行血管内皮细胞等散在分布细胞的研究和药物的筛选。为了增加CMC法的应用范围，本实验将CMC法与细胞生物学方法相结合，用人脐静脉血管内皮细胞ECV304制备细胞膜固定相(cell membrane stationary phase， CMSP)，建立了血管内皮细胞膜色谱模型，用CMC法首次研究了9种配体与内皮细胞上受体的生物亲和作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　1.1.1 细胞

　　来源于人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell， HUVEC)的人血管内皮细胞株EVC304，由中国科学院上海细胞研究所提供。

　　1.1.2 药品

　　阿托品(Atropine，分子量289.4)购自上海化学试剂采购供应站；R(-)QNB(分子量337.38)、S(+)QNB(分子量337.38)均购自RBI公司；东莨菪碱(Scopolamine，分子量384.3)、育亨宾(Youhimbin，分子量390.9)、BMY7378(分子量458.4)、哌唑嗪(Prazosin，分子量419.9)、(±)美托洛尔(Metoprolol，分子量267.38)均购自Sigma公司；山莨菪碱(6542，分子量386.29)购自山西晋西双鹤药业。

　　1.1.3 主要试剂

　　DMEM干粉培养基(GIBCO公司)、小牛血清(杭州四季青公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、磷酸二氢钠(Nah3PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、NaCl、盐酸(HCl)、磷酸(H3PO4)、乙醇(C2H5OH)等均为国产分析纯。

　　1.1.4 主要仪器

　　Gilson高效液相色谱系统，包括510泵、486型紫外检测器、7125型手动进样阀(美国Rheodyne)和Anastar色谱工作站(天津奥泰科技有限公司)；410型低温冷冻高速离心机(德国HERMLEZK)；AS5150A超声振荡仪(美国Auto science)；PHS2D型酸度计(上海第二分析仪器厂)；TB85型循环水浴(日本SHIMADZU)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　来源于人血管内皮细胞株ECV304，在37℃、50mL/L CO2及饱和湿度条件下，培养于含100mL/L小牛血清DMEM培养基中，常规传代[7]。

　　1.2.2 EVC304细胞膜的制备

　　当8个培养瓶(75cm2)的内皮细胞覆盖瓶底90%时，将其中4瓶做细胞膜。另外4瓶细胞冻存于液氮罐中保存。制膜方法：2.5g/L胰蛋白酶液消化，1000×g离心10min，弃上清，加入10mL低渗液，超声振荡20min，450×g离心20min，取上清液，16000×g离心20min，取沉淀为ECV304细胞膜，上述操作在4℃下进行。

　　1.2.3 EVC304细胞膜色谱柱的制备

　　取活化硅胶(5μm)0.3g，加入上述制备的ECV304细胞膜，4℃振荡60min，平衡后离心分离，沉淀物用0.6mL TrisHCl洗涤后，为ECV304细胞膜固定相。由药学系天然药物研究与工程中心提供。比较两个同种细胞膜色谱柱的稳定性。

　　1.2.4 9种配体对EVC304细胞膜CMC的研究

　　柱温为37℃；流动相为50mmol/L磷酸盐缓冲液(Na2HPO4)，pH＝7.4；流速为0.5mL/min；色谱柱需用流动相平衡3～4h，基线稳定后，分别进样分析；紫外检测波长为220～270nm(根据每种药物实测情况定)；灵敏度(AUFS)为0.2。

　　1.3 统计学处理

　　用Prim软件对药物在两个CMSP上的容量因子(K＇)进行相关性分析，取检验水准α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 内皮细胞形态学观察

　　倒置显微镜下可见培养的单层生长的内皮细胞为长梭型，边界清楚，胞浆丰富，核圆形或椭圆形，核仁1～2个。人脐静脉内皮细胞生长到融合状态时，呈“铺路石”状排列。

　　2.2 9种药物的CMC研究结果

　　将EVC304细胞膜色谱柱用50mmol/L磷酸盐缓冲液平衡3～4h后，根据九种药物紫外检测波长测定结果(220～270nm)分别进样分析。其中山莨菪碱(6542)为注射用针剂，规格为10g/L，用三蒸水配成浓度为3×10-3mol/L。其余药品均为白色固体粉末，用甲醇溶解，浓度均为3×10-3mol/L。计算不同药物在内皮细胞色谱柱上的容量因子K＇(表1)。药物在另一个EVC304细胞膜色谱柱上的亲和力研究方法同上(表2)。表1 药物在第一个EVC304细胞膜CMSP上的色谱作用参数（略）表2 药物在第二个EVC304细胞膜CMSP上的色谱作用参数（略）
　　
　　不同mAchR、αAR、βAR阻滞剂在第一个内皮细胞CMSP上亲和力顺序由大到小为：S(＋)QNB、哌唑嗪、R(－)QNB、阿托品、育亨宾、BMY7378、(±)美托洛尔、山莨菪碱、东莨菪碱。其容量因子分别为：14.289、13.667、11.121、6.794、4.758、4.386、3.926、2.424、2.412。药物在第二个EVC304CMSP上亲和力顺序由大到小为：哌唑嗪、S(＋)QNB、R(-)QNB、阿托品、育亨宾、BMY7378、(±)美托洛尔、东莨菪碱、山莨菪碱。其容量因子分别为：10.734、9.398、9.177、7.964、5.585、5.369、4.061、2.931、2.472。

　　2.3 药物在两个CMSP上的容量因子(K＇)相关性分析
　　根据同种药物在两个EVC304细胞膜色谱柱上容量因子的检测结果，用Prim软件进行相关性分析，结果表明药物在两个同种色谱柱的容量因子之间存在正相关关系(r=0.966)，且差异具有显著性意义(P<0.01，图1)。

　　3 讨 论
　　
　　人脐静脉作为培养内皮细胞的材料来源，具有取材方便，且能使实验结果更接近人体内皮细胞生长等优点。经体外培养的人脐静脉内皮细胞，不仅在形态和功能上与体细胞相似，还能在数量上呈几何级数增加，这为研究与内皮细胞有关的基础及临床医学课题提供了理想的细胞模型。本次实验首次研究了9种药物在内皮细胞CMSP上的保留情况。ECV304是由人脐静脉内皮细胞转化的细胞系，可以表达内皮细胞标志如WeibelPalada小体、纤溶酶原激活物(plasmiaogen activator， PA)等，它可以进行稳定传代培养，是原代内皮细胞培养的良好模型。
　　
　　在实验过程中，为保证比较结果的可靠性，要做到：①细胞膜制备方法保持一致。细胞膜制备在0～4℃进行，制备好后立即使用。②培养细胞的数量尽可能保持一致。两个CMC色谱柱所用的细胞膜均来自4瓶培养细胞(75cm2)。③实验条件要保持一致。本次实验流动相均选择37℃，50mmol/L，pH 7.4的磷酸盐缓冲液。因为随着流动相浓度的增加，洗脱能力增加，药物的保留时间缩短，容量因子减小。条件不一致数据没有可比性。
　　
　　实验选用的药物有mAchR拮抗剂：阿托品、山莨菪碱(6542)、东莨菪碱和QNB。QNB是目前最强的毒蕈碱受体拮抗剂，是理想的M胆碱受体鉴定工具药。哌唑嗪和BMY7378是α1AR拮抗剂；育亨宾是α2AR拮抗剂；美托洛尔是βAR拮抗剂。实验药物在第一次制备的内皮细胞CMSP上的容量因子与第二次实验结果略有不同，原因是所用的高效液相色谱仪仅有一台，不能同时研究两个色谱柱。第二次所用细胞经过液氮罐冻存，细胞有损失，使得药物在色谱柱上的保留时间缩短。但药物在两个内皮细胞CMSP上的容量因子之间存在正相关关系(r=0.966， P<0.01)。
　　
　　本次实验也证明了EVC304上存在M受体、α1AR、α2AR、βAR，其中βAR数目相对较少。用培养细胞制备CMSP后色谱柱的手性识别能力并没有提高，左旋和右旋QNB在色谱柱上的保留时间相差1min左右，消旋体美托洛尔没有被分开。随着CMC研究工作的一步步深入，其应用范围将逐步扩大，使之更符合药物作用的体内过程。CMC法将以快速、高效等特点成为受体研究和中草药筛选的新方法。

参考文献

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