抗CUEDC2单克隆抗体的制备及小鼠组织CUEDC2表达谱的检测

　　　　 作者：于鸣，穆蕊，李文龙，王晨辉，李爱玲，郭宁

【摘要】 　　目的 制备特异性识别CUE结构域蛋白2(CUE domain containing 2， CUEDC2)的单克隆抗体(mAb)，并检测CUEDC2蛋白在小鼠组织中的表达。方法 在大肠杆菌中融合表达GSThCUEDC2蛋白，纯化后免疫小鼠，制备mAb。采用Western blot方法检测mAb的特异性以及小鼠组织中CUEDC2蛋白的表达。结果 获得了可同时识别人源和鼠源CUEDC2 mAb，利用此mAb检测小鼠组织CUEDC2蛋白的表达水平，发现该蛋白的表达在不同小鼠组织中存在差异。结论 制备的CUEDC2 mAb特异性好，并可检测CUEDC2蛋白在小鼠组织中的表达，该mAb的制备为进一步研究CUEDC2的功能奠定了基础。

【关键词】 CUEDC2 单克隆抗体 组织表达

　　ABSTRACT: Objective To prepare monoclonal antibody (mAb) against CUE domain containing 2 (CUEDC2) protein and detect the expression level of CUEDC2 in mouse tissues. Methods Fusion protein GSThuman CUEDC2 (hCUEDC2) was expressed and purified， and mAb against CUEDC2 was prepared by using hybridoma technique. The specificity of the antibody and CUEDC2 expression in mouse tissues were detected by Western blot analysis. Results We obtained mAb against CUEDC2 protein， which recognized specifically both hCUEDC2 and mouse CUEDC2. The mAb could be used to detect expression level of CUEDC2 protein， which was different in various mouse tissues. Conclusion The prepared CUEDC2 has good mAb specificity and can be used to detect expression of CUEDC2 protein in mouse tissue， thus providing a useful tool for further investigation into the functions of CUEDC2.

　　KEY WORDS: CUE domain containing 2 (CUEDC2) protein; monoclonal antibody; tissue expression

　　CUE结构域蛋白2(CUE domain containing 2， CUEDC2)是我们通过酵母双杂交筛选获得的一个孕激素受体相互作用蛋白，由287个氨基酸组成。该蛋白功能尚不明。生物信息学分析提示，CUEDC2基因可能编码一个含有CUE结构域(泛素结合模体)的蛋白，故我们将其称之为CUE结构域2蛋白。CUEDC2的CUE结构域较小(约40个氨基酸残基)，中度保守，可存在于多种真核细胞蛋白。由于CUE结构域在单泛素化及多泛素化识别中发挥双重作用，提示CUEDC2在细胞生长调控中可能具有重要的功能。

　　为研究CUEDC2蛋白的功能，我们构建了含人源CUEDC2 cDNA(hCUEDC2)的原核表达载体，在大肠杆菌中获得了GSThCUEDC2融合蛋白的高效表达。应用谷胱甘肽琼脂糖4B珠子进行纯化，获得了纯度较高的重组融合蛋白。利用纯化的重组蛋白免疫小鼠，取免疫后小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0细胞融合，制备了单克隆抗体(monoclonal antibody， mAb)，对抗体的特性进行了鉴定，并进一步利用该抗体对CUEDC2在小鼠组织中的表达分布进行了分析。该特异性抗体的制备为深入研究CUEDC2蛋白的功能奠定了基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 质粒、菌株、细胞与动物

　　含hCUEDC2编码区序列的质粒pcDNA3.0FlaghCUEDC2由本实验室克隆并保存。原核表达载体pGEXKGGST、大肠杆菌DH5α、SP2/0小鼠骨髓瘤细胞均由本实验室购置并保存。雌性4～6周龄SPF级BALB/c小鼠由军事医学科学院动物中心提供。

　　1.2 生化试剂

　　限制性内切酶购自NEB公司，T4 DNA连接酶购自Invitrogen公司，PCR回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Promage公司，DNA分子量标准购自TaKaRa公司，蛋白质分子质量标准购自Fermentas公司，谷胱甘肽Sepharose 4B珠子购自Amersham Pharmacia Biotech公司。完全弗式佐剂、不完全弗式佐剂、还原型谷胱甘肽(GSH)、HAT及HT均购自Sigma公司。

　　1.3 表达载体的构建及鉴定

　　将含hCUEDC2 cDNA的质粒pcDNA3.0FlaghCUEDC2用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、纯化hCUEDC2片段；用同样的酶处理原核表达载体pGEXKGGST使之线性化。将分离纯化的载体片段及拟插入片段在T4 DNA连接酶的作用下连接，用连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过酶切鉴定所获阳性克隆(pGEXKGGSThCUEDC2)。

　　1.4 GSThCUEDC2融合蛋白的纯化

　　用重组载体pGEXKGGSThCUEDC2转化的大肠杆菌DH5α接种LB培养基，用IPTG(0.1mmol/L)20℃下进行低温诱导。用IPTG同时诱导pGEXKGGST空载体转化的大肠杆菌DH5α作为阳性对照。收集菌液超声后，应用谷胱甘肽Sepharose 4B珠子进行蛋白纯化。纯化后的谷胱甘肽Sepharose 4B珠子经GSH洗脱，获得GSThCUEDC2融合蛋白。然后，对纯化蛋白进行真空冻干及Bredford蛋白定量分析。

　　1.5 CUEDC2 mAb的制备

　　将100μg GSThCUEDC2融合蛋白与弗氏完全佐剂进行充分乳化，对4～6周龄BALB/c雌性小鼠进行首次皮下注射。首次免疫3周后，将100μg GSThCUEDC2融合蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化，对BALB/c小鼠进行第二次皮下注射。于第三次免疫后的第15天，经尾静脉采血，用ELISA法测定血清抗体的效价。在加强免疫3d后，取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0细胞按常规方法融合。通过间接ELISA法筛选，有限稀释法克隆化，并按常规方法制备腹水[1]。

　　1.6 CUEDC2 mAb的特异性鉴定

　　用pCDNA3.0FlaghCUEDC2、pCDNA3.0FlagmCUEDC及pCDNA3.0Flag空载体，分别转染293T细胞。转染48h后裂解细胞，应用SDSPAGE分离细胞裂解液，转印至硝酸纤维膜，Western blot分析抗体对CUEDC2蛋白的识别。一抗分别采用Flag mAb及CUEDC2 mAb，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，ECL显色后观察结果。

　　1.7 CUEDC2蛋白在小鼠组织中的表达分析

　　取BALB/c小鼠的脾、肺、胃、脑、睾丸、胰腺、小肠等组织，组织匀浆后应用CUEDC2 mAb进行Western blot分析[2]。

　　2 结 果

　　2.1 pGEXKGGSThCUEDC2重组质粒的鉴定

　　用连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单个克隆，用质粒提取试剂盒提取及纯化质粒DNA。通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，可从重组质粒pGEXKGGSThCUEDC2中切出约860bp的片段，表明hCUEDC2已成功地克隆入原核表达载体pGEXKGGST(图1)。序列测定结果证明，插入序列完全正确。

　　2.2 GSThCUEDC2融合蛋白的纯化

　　将pGEXKGGSThCUEDC2转化的大肠杆菌DH5α大量培养，在20℃下用IPTG(0.1mmol/L)进行低温诱导。收集菌液超声后，用谷胱甘肽Sepharose 4B珠子纯化重组蛋白。SDSPAGE分析结果显示，纯化后的融合蛋白的分子质量介于45～66ku之间，与理论预测的分子质量相似。作为蛋白纯化阳性对照的GST蛋白的分子质量介于25～35ku之间，亦与预期分子质量相同(图2)。

　　2.3 CUEDC2 mAb的特异性鉴定

　　用质粒pcDNA3.0FlagmCUEDC2和pcDNA3.0FlaghCUEDC2转染293T细胞，48h后裂解细胞，对裂解液进行Western blot分析。结果显示，用抗Flag mAb及抗CUEDC2 mAb作为一抗，可在相同部位检测到蛋白条带，而在转染pCDNA3.0Flag空载体的细胞裂解物中，两种抗体均未检测到蛋白质条带(图3)。结果表明，我们制备的抗CUEDC2 mAb可与CUEDC2蛋白发生特异性反应，并可同时识别人源和鼠源的CUEDC2蛋白。

　　2.4 CUEDC2蛋白在小鼠不同组织中的表达谱

　　应用我们制备的抗CUEDC2 mAb及Western blot初步检测了BALB/c小鼠的脾、肺、胃、脑、睾丸、胰腺、小肠等组织中CUEDC2蛋白的表达分布，结果显示，小鼠各组织中CUEDC2蛋白表达水平存在明显差异，脑、睾丸组织表达水平相对较高，胃组织表达水平相对较低，而其他组织未检测到CUEDC2蛋白的表达(图4)。

　　3 讨论

　　CUEDC2蛋白是一个未知功能的蛋白，我们在前期工作中发现其可与孕激素受体相互作用，进一步研究CUEDC2的功能需要识别该蛋白的特异性mAb。由于缺乏抗CUEDC2的商品化抗体，本研究目的是通过细胞融合的方法制备可特异性地识别CUEDC2蛋白的mAb。我们通过基因工程技术构建了含CUEDC2 cDNA的原核表达载体，在大肠杆菌中获得了GST
　　CUEDC2融合蛋白的表达，并获得了纯化的重组蛋白；用纯化的融合蛋白免疫小鼠，通过细胞融合技术制备可特异性识别CUEDC2蛋白的mAb，并对mAb的特性进行了鉴定，证实我们制备的抗CUEDC2蛋白的mAb可识别人源及鼠源CUEDC2蛋白。我们进一步应用抗CUEDC2 mAb对小鼠不同组织中CUEDC2蛋白的表达水平进行了检测，结果显示CUEDC2蛋白具有组织特异性表达的特征，提示CUEDC2可能在脑、睾丸等组织中发挥重要的作用。初步的研究结果为深入研究CUEDC2蛋白的功能提供了线索。我们在随后的研究中进一步证实，CUEDC2可与孕激素受体相互作用，通过泛素蛋白酶体通路促进孕激素诱导的孕激素受体的降解；CUEDC2可抑制孕激素受体的反式激活，抑制孕激素快速激活MAPK通路的能力及消弱孕激素对乳腺癌细胞增殖的效应[34]。总之，我们制备的特异性识别CUEDC2的mAb为揭示CUEDC2蛋白在细胞生命过程中的重要功能奠定了基础。

参考文献

　　[1]舒翠玲，温新宇，裴武红，等. 抗人FKBP52分子单克隆抗体的制备和鉴定 [J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2002， 18(5):491493.

　　[2]丁丽华，熊志红，王朝云，等. FHI2抗体的制备及其在癌细胞和组织中表达的检测 [J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23(8):765766.

　　[3]ZHANG PJ， ZHAO J， LI HY， et al. CUE domain containing 2 regulates degradation of progesterone receptor by ubiquitinproteasome [J]. EMBO J， 2007， 26(7):18311842.

　　[4]LI HY， LIU H， WANG CH， et al. Deactivation of the kinase IKK by CUEDC2 through recruitment of the phosphatase PP1 [J]. Nat Immunol， 2008， 9(5):533541.