不含氨基末端的PIF1解螺旋酶的纯化和初步功能研究

【摘要】 　　目的 从分子水平阐述人类PIF1解螺旋酶的生理功能，纯化只含有解螺旋酶模序，不含N末端的PIF1蛋白——PIF1△N，并对其生物化学活性进行检测。方法 以Hela细胞的cDNA文库为模版，PCR扩增得到PIF1的540～1923的cDNA序列，在cDNA的5′端引入六聚组氨酸标签后插入pET20b表达载体，得到重组质粒pET20PIF1△N。通过共转化此重组质粒和一个编码稀有rRNA的质粒，PIF1△N蛋白在大肠杆菌中得到表达。在4℃通过一系列亲和层析柱，用高效液相纯化系统纯化了PIF1△N蛋白，并检测其生物化学活性。结果 从Hela 细胞的cDNA文库中克隆了PIF1蛋白的540～1923的基因片段，使其在大肠杆菌中成功表达。建立了纯化PIF1△N蛋白的亲和层析方法， 并检测了其ATP酶活性。结论 不含N末端的PIF1蛋白-PIF1△N，具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性。

【关键词】 PIF1解螺旋酶 蛋白纯化 ATP酶

　　ABSTRACT: Objective To elucidate physiological functions of human PIF1 helicase at the molecular level， purify Nterminal truncated PIF1 helicase， PIF1△N， and assay its biochemical properties. Methods The Nterminal cDNA sequence of PIF1 helicase was amplified by PCR using the Hela cell cDNA library as template. The cDNA with a histidine tag at the Nterminus was inserted into the pET20b vector to produce recombinant plasmid. The recombinant PIF1△N was successfully expressed by cotransforming a plasmid encoding rare rRNA. At 4℃ through a series of affinity column the recombinant PIF1△N protein was purified by fast protein liquid chromatograph. The biochemical activity of PIF1△N was assayed. Results The cDNA fragment of human PIF1 from 540～1923 was cloned from Hela cDNA library， and the recombinant PIF1△N protein was successfully overexpressed in E.coli. The purification procedure of PIF1△N protein was established and its biochemical activity was identified. Conclusion Nterminal truncated PIF1 helicase， PIF1△N， has ATPase activity， which is DNA and Mg2+ dependent.

　　KEY WORDS: PIF1 helicase; DNA purification; ATPase

　　解螺旋酶能利用NTP水解释放的能量催化两条互补的DNA双链解开成单链，在几乎所有的核酸代谢中都有重要作用[1]。解螺旋酶的一个特点是其氨基酸序列中存在几个进化上非常保守的氨基酸模序(motif)，叫做解螺旋酶模序。解螺旋酶根据解螺旋酶模序被分成超级家族(superfamily)，绝大多数属于超级家族Ⅰ和Ⅱ[2]。

　　PIF1解螺旋酶家族属于超级家族Ⅰ，有很多重要的生理功能。线粒体PIF1蛋白参与线粒体DNA的重组及稳定 [3]，参与碱基切除修复以拮抗DNA自发的氧化损伤[45]，参于双链DNA断裂的修复从而增加细胞对溴化乙锭引起损伤的抗性[6]。细胞核PIF1蛋白能抑制端粒酶活性，参与DNA修复、参与冈崎片段的成熟及维持基因组的稳定[79]。由于PIF1解螺旋酶家族蛋白水溶性低、易于凝集，使得PIF1蛋白的纯化非常困难。目前为止，对PIF1蛋白的研究主要来自遗传学数据，生物化学的研究数据非常有限。

　　有关人类PIF1蛋白的功能目前尚不清楚。为了从分子水平阐明人类PIF1解螺旋酶的生理功能，我们克隆并纯化了不含N末端，但含有7个解螺旋酶模序的人类PIF1蛋白—PIF1△N，并且证明了PIF1△N具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性。

　　1 材料与方法

　　1.1 所用菌株与质粒

　　构建PIF1△N表达重组体的质粒为pET20b(Novagen)，表达菌株为E.coli BL21(DE3) (Promega)。

　　1.2 质粒构建

　　以Hela细胞的cDNA文库为模板，通过引物CATATGGGGGCCGAGCCTAGCACA和TCAGAGGATTGGGTCCATGTT PCR扩增PIF1△N的3′末端的含有解螺旋酶功能域的cDNA片段，命名为PIF1△N，经DNA测序证明序列正确后，于其N末端引入六聚组氨酸标签插入表达蛋白载体pET20b(Novagen)，产生重组表达质粒pETPIF1△N。

　　1.3 重组蛋白PIF1△N在大肠杆菌中的过量表达和纯化

　　重组质粒pETPIF1△N转化E.coli BL21(DE3)菌株，此菌株同时转化一个具有卡那霉素抗性的编码稀有tRNA的质粒。于15℃在含有250mg/L青霉素和30mg/L卡那霉素的LB培养液中培养，当细菌培养物生长到600nm的吸光度值为0.6时加入IPTG(200μmol/L)。继续培养14h，收获细胞，并悬溶于Buf I[50mmol/L Hepes NaOH(pH 7.5)，0.1mmol/L EDTA， 10mmol/L β巯基乙醇，1mol/L NaCl]，于液氮中冷冻。随后热裂解法裂解细胞，得到细胞裂解液。细胞裂解液由高效液相系统(GE Healthcare)层析纯化。具体过程为：1mL HiTrap鳌合柱(GE Healthcare)经0.1mol/L NiSO4处理与镍离子鳌合，再经含有50mmol/L咪唑的Buf A[50mmol/L Hepes NaOH(pH 7.5)，13mol/L Glycerol，10mmol/L β巯基乙醇，1mol/L NaCl]平衡。细胞裂解液上清加入咪唑使其终浓度达50mmol/L上柱，再用含咪唑的Buf A洗脱，PIF1△N蛋白被300mmol/L咪唑的Buffer A洗脱。收集含PIF1△N蛋白的洗脱液，上样于Superdex 200柱(GE Healthcare)，收集含PIF1△N蛋白的洗脱峰，于液氮中冷冻，再储存于-80℃备用。PIF1△N蛋白的表达纯化过程经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后考马斯亮蓝染色或六聚组氨酸单克隆抗体检测。

　　1.4 ATP酶活性的测定

　　ATP酶活性测定的反应混合液含有50mmol/L TrisHCL(pH 8.0)，2mmol/L DTT，1.2mmol/L MgCl2，0.25mg/mL BSA，2mmol/L[γ32P]ATP，M13 mp18单链DNA及11nmol/L PIF1△N蛋白，共20μL。反应温度为30℃，10min后由20mmol EDTA(pH8.0)终止。反应终止液用薄层层析法加以分离，分离产物用BioImaging Analyzer BAS2000(Fuji Photo Film Co.， Ltd.)分析，ATP水解的程度由无机磷酸的放射活性与未水解ATP的放射活性的比例测得。

　　2 结 果

　　2.1 重组PIF1△N在大肠杆菌中的表达

　　为了增加PIF1△N的表达，在传统的大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中转化pETPIF1△N质粒的同时，转化了编码稀有tRNA的质粒。大肠杆菌裂解液经SDSPAGE显示在分子质量约为52ku处有一IPTG诱导表达的蛋白带(图1A)。由六聚组氨酸单克隆抗体做Western blotting证明这是诱导表达的PIF1△N蛋白(图1B)。Western blotting还显示在未加IPTG时有泄露表达(图1B， 0 hour)。

　　2.2 重组PIF1△N蛋白的纯化

　　含有PIF1△N蛋白的大肠杆菌培养物经热裂解法裂菌，得到细胞裂解液。细胞裂解液上样于镍鳌合柱，分别用100mmol/L及300mmol/L咪唑洗脱，PIF1△N蛋白主要在300mmol/L处被洗脱出来，收集300mmol/L咪唑的洗脱液，即组分15、16(图2)。此蛋白洗脱液还包含一些凝集变性蛋白。再将PIF1△N蛋白洗脱液(组分15、16)上柱于Superdex进行凝胶过滤，凝集蛋白因为体积增加而首先被洗脱出来。第一个洗脱峰为凝集蛋白：组分3～9(图3)，弃去。活性蛋白PIF1△N单体在大约14mL处被洗脱出来(洗脱峰15、16组分)，即为纯化的PIF1△N蛋白单体(图3)。蛋白纯化过程由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳再由考马斯亮蓝染色及Western blotting确定。

　　2.3 ATP酶活性

　　ATP酶活性实验显示，PIF1△N在镁离子和单链DNA存在时，PIF1△N可以有效地水解ATP(图4A)。反应在前10min之内，为一级反应(图4B)。说明解螺旋酶的7个模序(motif)已经足够介导ATP酶活性。因此可以得出结论，不含N末端的PIF1△N蛋白因为具有解螺旋酶的7个模序也具有ATP酶活性。

　　3 讨 论

　　解螺旋酶因为参与几乎所有DNA代谢，在生物体内具有非常重要的作用。有一些解螺旋酶的突变会导致人类遗传病的发生，如着色性干皮肤病、Werner综合征、Bloom综合征等[10]。

　　PIF1解螺旋酶家族是5′到3′解螺旋酶，在从酵母到人的进化中非常保守。酵母PIF1蛋白具有参与DNA损伤修复、参与DNA复制及调节端粒酶活性等众多的生理功能[79]。尽管人们对酵母PIF1解螺旋酶的研究已经较为详尽，但对人类PIF1解螺旋酶的功能几乎一无所知。

　　 为了探讨人类PIF1解螺旋酶的生物化学功能，我们首先用5′RACE的方法得到了人类全长PIF1cDNA序列。人类PIF1基因的开放阅读框(ORF， open reading frame)为1923bp(base pair)，编码一个641个氨基酸的蛋白质。7个解螺旋酶模序位于开放阅读框的第670～1761核苷酸序列(相当于第224～587个氨基酸)。因为解螺旋酶模序对解螺旋酶的功能是必须的，所以我们克隆了不含N末端只包含7个解螺旋模序的从540到1926的cDNA片段，将其命名为PIF1△N，并构建了PIF1△N六组氨酸的融合质粒。一般PIF1同源蛋白在大肠杆菌中的表达都很低，我们猜测可能是由于大肠杆菌缺乏某些转运PIF1氨基酸的稀有tRNA[11]。为了提高PIF1△N在大肠杆菌中的表达，我们同时转入了一个编码稀有tRNA的质粒，使PIF1△N蛋白得到了很好的表达(图1)。大肠杆菌细胞收集液经热裂解法裂解后，经镍鳌合的层析柱进行亲和层析，PIF1△N蛋白在300mmol/L咪唑处洗脱出来(图2)。再经supedex凝胶过滤，去除凝集沉淀的PIF1△N变性蛋白，收集到了有活性的PIF1△N蛋白(图3)

　　解螺旋酶的解链需要消耗ATP水解释放的能量，所以解螺旋酶都偶联有ATP酶活性。我们通过ATP酶活性检测，证明了纯化的PIF1△N蛋白具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性(图4)。这说明7个解螺旋酶模序，即使没有N末端的多肽片断，也足够刺激ATP酶的活性。
　　
　　虽然目前还没有有关人类PIF1蛋白的病理学报告，但是其酵母同源蛋白对基因组的完整性具有重要作用，暗示了人类PIF1也可能具有重要生理功能。不含N末端的PIF1解螺旋酶的纯化和初步生物化学活性的功能研究，为从分子水平研究人类PIF1的生理功能和作用机制奠定了基础。

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