HBV preS1基因酵母表达载体的构建及表达

　　　　 作者：张曦，蔺淑梅，吴列秀，陈天艳，叶峰，赵英仁，张树林

【摘要】 　　目的 构建HBV preS1基因的酵母表达载体，探讨HBV preS1蛋白的功能。方法 以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板，聚合酶链反应(polymerase chain reaction， PCR)扩增HBV preS1基因，克隆到pGEMT载体中命名为TpreS1，以NcoⅠ和MluⅠ双酶切TpreS1后回收与酵母表达载体pSos连接，对重组质粒进行序列测定后命名为pSospreS1，经醋酸锂法将其转化酵母菌cdc25(a)，提取酵母蛋白质进行Western免疫印迹分析。结果 成功构建了HBV preS1基因的酵母表达载体，Western免疫印迹分析显示HBV preS1基因在酵母细胞中正确表达。结论 pSospreS1的构建为通过SOS招募系统(sosrecruitment system， SRS)筛选与HBV preS1蛋白相互作用的蛋白和进一步探讨HBV preS1蛋白在HBV致病中的作用奠定了基础。

【关键词】 乙肝病毒 preS1蛋白 酵母表达载体

　　ABSTRACT: Objective To construct the yeast expression vector of HBV preS1 gene for investigating the potential role of preS1 protein in mediating the attachment of HBV particles to human hepatocytes. Methods PCR was performed to amplify HBV preS1 gene from the plasmid PCP10/HBV ayw subtype containing the whole fragment of HBV， and the PCR product was cloned into pGEMT vector and then named TpreS1. HBV preS1 gene was cut from TpreS1 by NcoⅠ and MluⅠ， and cloned into yeast expression plasmid pSos; the reconstructed plasmid was tested by autosequencing assay and named pSospreS1. pSospreS1 was transformed into yeast cell cdc25(a) by LiAc mediated transformation， and the yeast protein was isolated and analyzed by Western blot. Results The yeast expression vector of HBV preS1 gene was constructed successfully， and the presence of HBV preSl protein in yeast cells was confirmed by Western blot analysis. Conclusion Reconstruction of pSospreS1 has laid a foundation for better understanding of the mechanism of HBV preS1 protein in viral endocytosis and is helpful in seeking the preS1 related protein that is supposed to interact with preS1 protein in vitro by sosrecruitment system.

　　KEY WORDS: hepatitis B virus; preS1 protein; yeast expression vector

　　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)是一种严重危害人类健康的重要病原体，其感染人体后可引起急、慢性乙型肝炎，并与肝硬化、肝癌密切相关。和其他病毒一样，HBV也是通过与靶细胞表面的相应受体结合而进入细胞，从而实现对机体的感染。preS1区是HBV与肝细胞膜的直接结合位点。目前认为preS1蛋白与HBV的急性感染[1]、介导入胞[2]、病毒复制、转录和分泌有关。因此，研究HBV preS1蛋白及其肝细胞受体，对进一步阐明乙型肝炎的发病机制具有重要的意义。为了进一步研究HBV preS1蛋白的功能及其相关作用蛋白在HBV入胞中的作用，我们构建了HBV preS1基因的酵母表达载体。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　SOS招募系统(sosrecruitment system， SRS)包括cdc25酵母菌株，诱饵蛋白融合载体pSos，靶蛋白融合载体pMyr，阳性对照质粒pSos MAFB、pMyr MAFB、pMyr SB，阴性对照质粒pSos ColⅠ、pMyr Lamin C，预制肝文库均为Stratagene公司产品；HBV ayw质粒由本室保存；PCR相关试剂及T载体、T4连接酶均购自TaKaRa公司；限制性内切酶NcoⅠ、MluⅠ购自NEB公司；酵母培养及转化相关试剂购自Clontech公司；Hep B preS1的单克隆抗体为SANTA公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PCR引物设计和合成

　　根据HBV ayw亚型的preS1基因序列设计特异性引物，上游引物P1：CCA TGG CG ATG GGG CAG AAT CTT TCC AC；下游引物P2：ACG CGT TTA GGC CTG AGG ATG AGT GTT TCT C，由上海生工生物工程公司合成。

　　1.2.2 目的基因的扩增

　　以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板进行PCR扩增。反应体系：质粒1μL，10×Buffer 5μL，dNTP(10mmol/L)1μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，P1(10μmoL/L)1μL，P2(10μmoL/L)1μL，Taq DNA聚合酶(5u/μL)0.6μL，加灭菌水至终体积50μL。反应条件：94℃ 3min，94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环，72℃ 5min。取5μL反应产物进行20g/L琼脂糖凝胶电泳分析。

　　1.2.3 PCR产物的克隆鉴定

　　PCR产物经北京鼎国胶回收试剂盒回收纯化后，与T载体按克分子3∶1的比例，在T4连接酶的催化下，16℃过夜进行体外连接重组，将连接产物全部转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在铺有IPTG和XGal的氨苄青霉素LB平板上进行蓝白菌落筛选。随机挑取白色菌落，以碱裂解法小量提取质粒并行PCR及双酶切鉴定后，由上海生工生物工程公司进行测序，测序正确者命名为TpreS1。

　　1.2.4 诱饵质粒的构建和鉴定

　　用NcoⅠ和MluⅠ双酶切TpreS1和pSos，回收preS1及pSos载体片段，用T4连接酶进行体外连接重组，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌落PCR筛选出阳性克隆后，以碱裂解法小量提取质粒，行限制性内切酶分析，鉴定正确者送上海生工生物工程公司利用酵母表达载体pSos的引物(P1：CCAAGACCAGGTACCATG；P2：GCCAGGGTTTTCCCAGT)测序，测序正确者命名为pSospreS1。

　　1.2.5 制备酵母感受态细胞

　　所用酵母菌株为cdc25(a)，采用醋酸锂转化法，按照试剂盒(Stratagene公司)说明书操作。将冻存的cdc25(a)划线接种于新鲜的YPAD平板，倒置于室温(22～25℃)孵育4～6d，挑取4～5个单克隆于1mL YPAD液体培养基中，剧烈振荡后接种于含50mL YPAD的250mL三角烧瓶中，室温(22～25℃)、220～250r/min振摇14～16h至A600>1.0。在2L的三角烧瓶中用YPAD稀释过夜菌液后(终体积300mL，A600=0.2～0.3)，置摇床室温(22～25℃)、220～250r/min振摇3h至A600>0.7。取75μL菌液铺于YPAD平板，封口膜封闭后置37℃孵育4～6d。将剩余的菌液室温(22～25℃)、1000r/min离心5min，弃上清；以50mL ddh3O重悬细胞，再置室温(22～25℃)、1000r/min离心10min，弃上清；用50mL LiSORB重悬细胞，室温(22～25℃)孵育30min，室温(22～25℃)1000r/min离心5min，弃上清；再用300μL LiSORB重悬酵母细胞，加入600μL预先准备好的鲑精DNA与LiSORB的混合物，小心轻柔完全混匀，加入5.4mL PEG/LiOAc和530μL DMSO，小心彻底混匀，在1.5mL的Ep管中分装500μL，其余的每管100μL分装。

　　1.2.6 转化酵母感受态细胞

　　将质粒pSospreS1和pSos分别加入100μL制备好的cdc25(a)酵母感受态细胞。每管加入2μL新鲜制备的1.4mol/L β巯基乙醇，小心混匀后置室温(22～25℃)孵育30min，42℃热休克20min，迅速置冰上3min，14000r/min室温(22～25℃)离心30s，弃上清，以500μL 1mol/L的山梨醇悬浮细胞，将转化液全部铺于100mm SD/glucose (L)琼脂平板上，置室温(22～25℃)孵育4～6d至长出单克隆。挑取pSospreS1平板上较大(直径>2mm)的菌落，应用酵母表达载体pSos的引物进行酵母菌落PCR，快速筛选酵母转化子，鉴定转化是否成功。

　　1.2.7 pSospreS1在酵母细胞中的表达

　　挑取pSospreS1和pSos单克隆分别接种于含5mL SD/glucose (L)液体培养基的50mL离心管中，置振荡器室温(22～25℃)、大于250r/min培养2～3d至A600>1.0，1000r/min室温离心5min，弃去上清液；用1mL冰预冷的ddh3O重悬酵母细胞后，加入150μL新鲜制备的NaOH/β巯基乙醇，漩涡混匀30s，置冰上15min；再次漩涡混匀后加入150μL的TCA水溶液(550g/L)，漩涡混匀后置冰上10min，12000r/min、4℃离心10min，弃上清后重复离心一次；用30μL SU buffer重悬蛋白抽提物，65℃水浴3min，行80g/L SDSPAGE电泳，转膜，Western免疫印迹分析按常规方法进行。一抗为1∶200稀释的Hep B preS1的单克隆抗体，二抗为1∶500稀释的碱性磷酸酶标记的马抗鼠IgG，BCIP/NBT显色。

　　2 结 果

　　2.1 PCR扩增HBV preS1基因编码序列

　　以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板，在50μL反应体系中进行PCR。取扩增产物5μL，在20g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，可见扩增片段约为324bp(图1)，与预期片段大小一致，且无非特异性扩增现象。

　　2.2 HBV preS1基因的克隆鉴定

　　将回收纯化后的PCR产物与T载体连接后获得的重组质粒命名为TpreS1，首先行PCR鉴定，再用NcoⅠ和MluⅠ对TpreS1进行双酶切鉴定。鉴定正确的TpreS1重组质粒进行测序，序列分析表明所扩增的preS1基因序列与HBV ayw亚型的preS1基因序列完全一致(GenBank DQ315776)。

　　2.3 构建和鉴定诱饵质粒

　　2.3.1 用NcoⅠ和MluⅠ双酶切TpreS1和pSos后(图2)，回收preS1及pSos载体片段，用T4连接酶进行体外连接重组。

　　2.3.2 对体外连接重组后生长的单克隆随机挑取5个进行菌落PCR鉴定(图3)。

　　2.3.3 将筛选出的阳性克隆提取质粒，以NcoⅠ和MluⅠ双酶切，然后在20g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定(图4)，可见插入片段大小正确。

　　2.3.4 利用酵母表达载体pSos的引物对鉴定正确的pSospreS1重组质粒进行测序，序列分析表明插入片段的基因序列与HBV ayw亚型的preS1基因序列完全一致(GenBank DQ315776)，插入方向正确，融合区域的读码框正确，表明诱饵质粒构建成功。

　　2.4 提取pSos和pSospreS1质粒的酵母蛋白质，进行SDSPAGE和Western免疫印迹分析 结果显示对照无表达，而转化了pSospreS1者Sos蛋白(约116.7ku)和preS1蛋白(约11.9ku)融合表达成功，Western免疫印迹分析可见明显目的条带(约128ku)且无杂带(图5)。

　　3 讨论

　　已知病毒感染机体的第一步是通过病毒吸附蛋白(virus attachment protein， VAP)与相应宿主细胞受体结合而实现的，这一过程常常成为决定病毒侵嗜范围与发病机制的主要因素。已有研究证实HBV preS1蛋白在HBV附着、侵入肝细胞的过程中发挥着重要作用。近年来，随着认识的逐渐深入，人们发现其不仅参与HBV的装配[34]和分泌[5]，还可调节HBV引起的细胞及体液免疫，增强新型基因疫苗的免疫效应[6]，提示preS1蛋白在慢性乙型肝炎的发生、发展过程中起着重要的作用。然而由于研究方法和策略的差异，在HBV preS1蛋白受体的确认上众说纷纭[7]。目前已知的在肝细胞膜上能与HBV preS1蛋白结合的分子(可能的HBV受体) 均是蛋白质[89]，如：IL6、IgA、人源去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)、HBV结合因子(HBVBF)[10]、p80(protein 80)[11]、HBV结合蛋白(HBVBP)[12]等。因此进一步探明HBV preS1蛋白及其受体的结构、具体功能及作用机制对于预防和阻断HBV感染肝细胞，阻止其进一步作用，以及控制慢性乙型肝炎的蔓延均具有深远的意义。

　　酵母双杂交系统作为发现和研究活细胞内蛋白质与蛋白质之间相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛的运用。该系统是在真核模式生物酵母中进行的，不但可用来研究活细胞内蛋白质之间的相互作用， 而且还能用来发现新的作用蛋白质，是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。现在国内外已有很多学者将其应用于HBV preS1蛋白受体的研究，但是由于在传统的GAL4 双杂交系统中HBV preS1蛋白存在强烈的自激活作用，尤其是在preS1蛋白与肝细胞相互作用的关键部位(21～47aa)，使假阳性率过高，限制了研究的进展。近年来新出现的一种酵母双杂交系统—SRS(sosrecruitment system)，它不像GAL4系统那样需要依赖于转录激活，在不宜采用GAL4系统的一些检测中发挥着重要作用；同时它还可以用来检测一些不能很好地定位于细胞核的蛋白质之间的相互作用，并且允许被检测的蛋白质发生转录后修饰，因此已被用于多种膜蛋白的研究[1314]。

　　我们以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板，PCR扩增HBV preS1基因的全长基因序列，与酵母表达载体pSos进行体外连接重组，成功构建了诱饵质粒pSospreS1。诱饵质粒pSospreS1成功转化cdc25(a)酵母感受态细胞后，对其酵母蛋白提取物行Western免疫印迹分析，用HBV preS1蛋白的单克隆抗体检测到约128ku的蛋白条带，表明HBV preS1基因与hSos基因片段在cdc25酵母细胞融合表达成功。本研究为通过SRS筛选与HBV preS1蛋白相互作用的蛋白分子，进一步研究HBV preS1基因及其表达产物preS1蛋白在HBV入胞中的作用奠定了实验基础，也为制备受体模拟分子，通过阻断病毒入胞从而预防和治疗乙型肝炎创造了条件。

参考文献

　　[1]LE GUILLOU DB， DUCLOSVALLEE JC， EBERLE F， et al. Evaluation of an enzymelinked immunosorbent assay for detection and quantification of hepatitis B virus preS 1 envelope antigen in serum samples:comparison with two commercial assays for monitoring hepatitis B virus DNA [J]. Viral Hepat， 2000， 7(5):387392.

　　[2]ATKINS GJ， QIAO M， COOMBE DR， et al. Hepatitis B virus binding to leucocyte plasma membranes utilizes a different region of the preS1 domain to the hepatocyte receptor binding site and does not require receptors for opsonins [J]. Immunol Cell Biol， 1997， 75(3):259266.

　　[3]POISSON F， SEVERAC A， HOURIOUX C， et al. Both preS1 and S domains of hepatitis B virus envelope proteins interact with the core particle [J]. Virology， 1997， 228(1):115120.

　　[4]YU M， EMERSON SU， COTE P， et al. The GDPAL region of the preS1 envelope protein is important for morphogenesis of woodchuck hepatitis virus [J]. Hepatology， 1998， 27(5):14081414.

　　[5]BRUSS V， THOMSSEN R. Mapping a region of the large envelope protein required for hepatitis B virion maturation [J]. J Virol， 1994， 68(3):16431650.

　　[6]RAZ R， DAGAN R， GALLIL A， et al. Safety and immunogenicity of a novel mammalian cellderived recombinant hepatitis B vaccine containing PreS1 and PreS2 antigens in children [J]. Vaccine， 1996， 14(3):207211.

　　[7]CHOUTEAU P， LE SEYEC J， CANNIE I， et al. A short N proximal region in the large envelope protein harbors a determinant that contributes to the species specificity of human hepatitis B virus [J]. J Virol， 2001， 75(23):1156511572.

　　[8]SCHNEIDERSCHAULIES J. Cellular receptors for viruses:links to tropism and pathogenesis [J]. J Gen Virol， 2000， 81(Pt 6):14131429.
[9]METTENLEITER TC. Brief overview on cellular virus receptors [J]. Virus Res， 2002， 82(12):38.

　　[10]BUDKOWSKA A， MAILLARD P， THERET N， et al. Activation of the envelope proteins by a metalloproteinase enables attachment and entry of the hepatitis B virus into T lymphocyte [J]. Virology， 1997， 237(1):1022.

　　[11]RYU CJ， CHO DY， GRIPON P， et al. An 80kilodalton protein that binds to the preS1 domain of hepatitis B virus [J]. J Virol， 2000， 74(1):110116.

　　[12]DE FALCO S， RUVOLETTO MG， VERDOLIVA A， et al. Cloning and expression of a novel hepatitis B virusbinding protein from HepG2 cells [J]. J Biol Chem， 2001， 276(39):3661336623.

　　[13]DUAN Z， LI FQ， WECHSLER J， et al. A novel notch protein， N2N， targeted by neutrophil elastase and implicated in hereditary neutropenia [J]. Mol Cell Biol， 2004， 24(1):5870.

　　[14]KIM Y， CHATTOPADHYAY S， LOCKE S， et al. Interaction among Btn1p， Btn2p， and Ist2p reveals potential interplay among the vacuole， amino acid levels， and ion homeostasis in the yeast Saccharomyces cerevisiae [J]. Eukaryot Cell， 2005， 4(2):281288.