安非他明对小鼠白细胞介素10释放的影响及多巴胺D3受体的调控作用

　　　　 作者：陈艳炯，朱俊艳，张洪波，魏曙光，阎春霞，郑海波，任会勋，陈腾

【摘要】 　　目的 研究安非他明(AM)对细菌脂多糖(LPS)刺激后小鼠白细胞介素10(interleukin10， IL10)释放的影响以及多巴胺D3受体在此过程中参与的调控作用。方法 实验Ⅰ：采用多巴胺D3受体基因敲除小鼠(D3RKO)以及具有相似遗传背景的野生型小鼠(C57BL/6J)，腹腔注射AM(5mg/kg)10min后再注射LPS(150μg/kg)刺激，在LPS给药后不同时间点(0、30、60、90、120、240min)心脏穿刺抽血进行IL10测试，观察上述不同时间点D3RKO和C57BL/6J小鼠IL10的分泌情况。实验Ⅱ：在实验Ⅰ所确定的小鼠IL10分泌最高时间点，观察不同剂量AM (0、2、5、10mg/kg) 对D3RKO和C57BL/6J小鼠IL10分泌的影响。结果 实验Ⅰ：AM 5mg/kg在LPS注射后可以引起D3RKO和C57BL/6J小鼠IL10分泌增多，其中60min达最大值，与生理盐水对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。实验Ⅱ：C57BL/6J小鼠以AM 5mg/kg作用后IL10增多最为显著，D3RKO小鼠以AM 2mg/kg作用后IL10升高最为显著，与生理盐水对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，且二者之间亦存在统计学差异。结论 AM对小鼠免疫功能的抑制可能是通过增加IL10分泌而起作用；小剂量AM即可引起D3RKO小鼠血中IL10升高，提示多巴胺D3受体可能参与了AM对小鼠免疫功能抑制作用的调控。

【关键词】 安非他明 白细胞介素 10 多巴胺D3受体 细菌脂多糖 基因敲除小鼠

　　ABSTRACT: Objective To study the effects of amphetamine (AM) administration on the production of interleukin10 (IL10) following an intraperitoneal injection (ip) of bacterial lipopolysaccharide (LPS， 150μg/kg) in mice and the role of dopamine D3 receptor involved in it. Methods In section Ⅰ: dopamine D3 receptor knockout mice (D3RKO) and wild type mice (C57BL/6J)， both exhibited a similar genetic background， received either vehicle(normal saline， NS) or AM (5mg/kg ip) 10min prior to LPS (150μg/kg) in vivo immune challenge， were sacrificed 0， 30， 60， 90，120， or 240min later by anesthetized with sodium pentobarbital; in sectionⅡ: C57BL/6J and D3RKO mice received AM at different dose (0， 2， 5， 10mg/kg) 10min prior to either vehicle or LPS， and were sacrificed 60min later. In anesthetized mice， blood was collected via cardiac puncture using a syringe without an anticoagulant. IL10 of serum was measured by means of commercially available enzymelinked immunosorbent assay. Results In section Ⅰ: under the treatment of AM， the greatest effect was observed at 60min after LPS challenge in both C57BL/6J and D3RKO mice. In sectionⅡ: the administration of AM at dose of 5mg/kg significantly increased LPSinduced IL10 production in C57BL/6J mice， but significantly increased LPS　induced IL10 production at dose of 2mg/kg in D3RKO mice， versus other doses of AM (P<0.05). Conclusion Our results showed that IL10 plays a role in the immune suppression caused by AM. A smaller dose of AM increased IL10 of D3RKO compared with wild type， indicating that D3R mediates immune inhibition of AM.

　　KEY WORDS: amphetamine; interleukin10; dopamine D3 receptor; lipopolysaccharide; knockout mice

　　研究表明，药物滥用可导致动物胸腺和脾脏萎缩、淋巴细胞数目及亚群减少、细胞因子含量改变等，可卡因、鸦片、大麻和安非他明(AM)等毒品的滥用可能直接或通过神经免疫途径间接损伤免疫功能。白细胞介素10(interleukin10， IL10)是重要的免疫调节因子，又名细胞因子合成抑制因子。CONNOR[1]报道如没有细菌脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)的刺激IL10几乎检测不到，因此认为生理状态下IL10的分泌量极低。LPS作为外源性致炎物质能够有效地激活单核巨噬细胞上的Toll样受体(Tolllike receptor， TLR)，从而引起IL10合成和释放[2]。研究AM对LPS刺激下IL10含量的影响，可能对研究AM依赖者免疫功能抑制的机制具有一定意义。
　　既往研究表明，安非他明等药物产生依赖与大脑多巴胺系统密切相关，多巴胺D3受体(dopamine 3 receptor， D3R)在AM依赖形成过程中发挥了重要作用。据此我们推测，AM对机体免疫功能的抑制作用也有可能与中枢多巴胺系统有关。因此本研究采用多巴胺D3受体基因敲除小鼠(dopamine 3 receptor knockout， D3RKO)为对象，以IL10为观察指标，研究AM对小鼠IL10的分泌的影响以及多巴胺D3受体参与的作用，旨在为进一步研究AM依赖对机体免疫的影响机制奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　D3RKO小鼠(美国芝加哥大学徐明教授馈赠，遗传背景见文献[3]，为C57BL/6J×sv129)和具有相似遗传背景的野生型(wildtype， WT)C57BL/6J小鼠(西安交通大学医学院实验动物中心提供)各56只，体重(20±2)g，雌雄各半，随机分为实验Ⅰ(24只)和实验Ⅱ(32只)。实验动物饲养在SPF级动物房，层流架中分笼饲养，每笼3只，室温(22±3)℃，12～12h昼夜循环非直接光照条件下生活，自由进食水。

　　1.2 实验药品及配制

　　硫酸安非他明粉剂(中国生物制品研究所)，实验前用9g/L灭菌生理盐水稀释为0.2、0.5、1.0mg/mL，应用剂量为2、5、10mg/kg体重；细菌脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)(L2654，大肠杆菌血清型O26：B6)购自Sigma公司，在1mg包装瓶中加入1mL生理盐水制成1g/L的贮备液，-20℃保存，临用时稀释为15mg/L，应用剂量为150μg/kg体重；IL10双抗体夹心ELISA检测试剂盒，为奥地利Bender Medsystems Diagnostics GmbH公司产品；戊巴比妥钠粉剂由国药集团化学试剂有限公司生产，批号：F20041117，称取戊巴比妥钠50mg溶解于20mL生理盐水制成2.5g/L的工作液，应用剂量为25mg/kg体重。每种溶剂每次腹腔注射剂量均为10mL/kg。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 实验Ⅰ：AM对LPS给药后不同时间点小鼠IL10分泌的影响　　C57BL/6J和D3RKO小鼠腹腔注射(intraperitoneal injection， ip)生理盐水(NS)或AM(5mg/kg)后10min再ip NS(0min)或LPS(150μg/kg)(根据

参考文献

[6]药物的等效剂量关系得出)，在ip LPS后30、60、90、120、240min(n=2)分别处死小鼠收集血液。用2.5g/L戊巴比妥钠溶液(10mL/kg)腹腔注射麻醉小鼠，打开胸腔采集心血，注入有抗凝剂(0.1mol/L EDTA，50μL)的EP管中，立即在4℃ 2500r/min离心15min，吸取上清分装，-80℃保存备ELISA检测用。

　　1.3.2 实验Ⅱ：不同剂量AM对C57BL/6J和D3RKO小鼠IL10分泌的影响 基于实验Ⅰ中LPS注射后60min血中IL10的含量最高的结果，本组实验选择LPS注射60min后处死小鼠采集心血。C57BL/6J和D3RKO小鼠分为4组：NS组(对照组，n＝4)和AM 2、5、10mg/kg组(n＝4)，ip NS或AM后10min再分别用NS或LPS(150μg/kg)激发，60min后处死小鼠采集心血。余同实验Ⅰ。

　　1.3.3 IL10的检测

　　小鼠血清IL10的检测按照操作说明书进行。

　　1.4 统计学分析

　　实验数据以(±s)表示，应用SPSS 13.0统计软件行单因素方差分析(oneway ANOVA)。不同药物处理组(AM、LPS和NS)、鼠的基因型和AM各个剂量组之间为组间变量，如有差异，采用Fisher's LSD进行post hoc多重比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 AM对LPS给药后不同时间点小鼠IL10分泌的影响
　　C57BL/6J小鼠ip NS、AM 5mg/kg后10min给予外源性LPS(150μg/kg)诱导，结果显示注射AM和NS小鼠间血中IL10的含量有统计学差异[F(1，23)=4.903， P<0.05]，LPS给药后各时间点之间亦有差异[F(5，23)=6.99， P<0.01](图1A)。进一步做最小显著差异(LSD)多重比较，显示LPS给药60min后IL10的含量最高。药物处理组(AM和NS) 和LPS之间有交互作用[F(5，12)=48.519， P<0.01，图1]。
　　
　　D3RKO小鼠ip NS、AM 5mg/kg后10min给予外源性LPS(150μg/kg)刺激，结果显示AM和NS间血中IL10的含量有统计学差异[F(1，23)=4.543， P<0.05]，LPS给药后各时间点之间有差异[F(5，23)=5.862， P<0.01](图1B)。进一步做最小显著差异(LSD)多重比较，显示LPS给药60min后IL10的含量最高。药物处理组(AM和NS)和LPS之间有交互作用 [F(5，12)=20.351， P<0.01]；C57BL/6J和D3RKO小鼠间没有统计学差异[F(1，47)=0.314， P=0.578>0.05，图1]。

　　2.2 不同剂量AM对C57BL/6J和D3RKO小鼠IL10分泌的影响

　　在C57BL/6J小鼠ip NS和AM 2、5、10mg/kg后10min给予外源性NS和LPS(150μg/kg)诱导，结果显示AM各剂量间IL10含量有统计学差异[F(3，31)=5.115， P<0.05]。进一步做最小显著差异(LSD)多重比较，显示AM 5mg/kg给药后IL10分泌最多。刺激物NS和LPS之间也有显著性差异[F(1，31)=9.577， P<0.01，图2A]。
　　
　　在D3RKO小鼠ip NS和AM 2、5、10mg/kg后10min给予外源性NS和LPS(150μg/kg)诱导，结果显示AM各剂量之间有差异[F(3，31)=4.255， P<0.05]。进一步做最小显著差异(LSD)多重比较，显示AM 2mg/kg给药后IL10分泌最多。刺激物NS和LPS之间也有显著性差异[F(1，31)=5.641， P<0.05]；但C57BL/6J和D3RKO小鼠之间没有统计学差异[F(1，63)=0.001， P＝0.973>0.05，图2B]。

　　3 讨 论

　　IL10由单核巨噬细胞分泌，具有显著的细胞免疫抑制作用，主要表现为抑制T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞分泌促炎性因子，抑制Th0细胞向Th1细胞的转化等。因此，检测IL10的变化对揭示机体的免疫功能具有一定意义。本研究通过检测安非他明对内源性免疫抑制因子IL10分泌的影响，结果显示腹腔注射AM可以引起小鼠IL10分泌的增高，其中中等剂量AM(5mg/kg)在LPS注射后30～90min可以使D3RKO和C57BL/6J小鼠IL10的分泌增多，60min达最大值，与生理盐水对照组相比差异显著。提示AM可能通过增加IL10分泌对免疫系统产生抑制作用。CONNOR等[4]研究发现体内急性给MDMA(AM的一种衍生物)后可以增加LPS诱导的IL10的合成，与本研究结果一致。中脑导水管灰质区急性注射吗啡可抑制大鼠NK细胞和T细胞功能，IL2的分泌量减少[5]。吗啡等阿片类物质通过直接和间接作用两条途径，在神经系统和内分泌系统的共同参与下，作用于非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫等各个环节发挥其抑制作用，导致机体免疫功能降低甚至缺陷。我们推测，AM对小鼠IL10的影响也可能和吗啡对IL2的作用结果类似，但是具体的机制还有待于进一步研究。
　　
　　KUBERA等[6]也曾报道AM抑制免疫的作用机制可能是通过神经内分泌的间接通路完成的，他认为AM可以激活下丘脑垂体肾上腺(HPA)轴、交感神经系统(SNS)和肾上腺髓质(SAM)，刺激促肾上腺皮质激素、肾上腺素或去甲肾上腺素的释放。体外实验表明，儿茶酚胺类可以增加LPS激发后巨噬细胞生成IL10(mRNA和蛋白)，这可能是因为β肾上腺素受体的激活，增加了细胞内cAMP的浓度，cAMP积聚使Th0细胞向Th3转化，促使IL10的分泌，使细胞免疫相关的细胞因子释放减少，起到抑制机体免疫的功能。若提前给予β肾上腺素受体抑制剂纳多洛尔则能完全阻断应激诱导的IL10产生[7]。
　　
　　雷志明等[8]的实验证实吗啡对小鼠免疫功能的影响存在着种属及剂量差异，发现LACA小鼠在皮下注射60～140mg/kg的吗啡时免疫功能受到明显的抑制。CONNOR等[9]有类似的发现， 他们采用腹膜内注射10mg/kg的苯丙胺衍生物亚甲基二氧基甲基苯丙胺、亚甲基二氧基苯丙胺和氟苯丙胺，指出苯丙胺的几种衍生物对循环血液中IL2的产生没有明显的改变；而苯丙胺的衍生物3，4亚甲二氧基苯丙胺在行腹膜内注射7.5～10mg/kg体重时可以引起大鼠循环血液中淋巴细胞的减少以及抑制淋巴细胞增殖，由此可以推测苯丙胺对大鼠免疫系统的影响与剂量有关。
　　
　　本研究同时以LPS注射后60min为观察点，发现AM各剂量(2、5、10mg/kg)组在LPS注射60min后均可使D3RKO和C57BL/6JJ小鼠IL10的分泌明显增多，与生理盐水对照组相比差异有统计学意义。其中C57BL/6J小鼠以AM 5mg/kg作用后IL10增多最为显著，而D3RKO小鼠则以AM 2mg/kg作用后IL10显著升高，且二者之间有显著差异。产生差异的原因应该与多巴胺D3受体有关。提示多巴胺D3受体可能参与了AM对小鼠免疫功能抑制作用的调控， 对AM成瘾所导致的免疫功能损害具有一定的保护作用。
　　
　　XU和FAUCHEY等[3， 10]认为，正常情况下D3受体可能起着对抗D2受体的作用，在D3RKO小鼠，由于D3受体基因缺失，对D2受体的对抗作用消失，从而使D2受体的作用相对增强；AM给药后激活D2R，在低剂量(2mg/kg)时就使免疫细胞大量分泌IL10。而在C57BL/6J小鼠，由于D3R正常存在，而D3R的结合力又比D2R高，因此需要较大剂量AM(10mg/kg)来消除D3R对D2R的对抗作用后，然后激活D2R使免疫细胞分泌IL10增多。该实验的结果还与本课题组的CPP实验结果具有一致性。在CPP实验中，D3RKO小鼠较C57BL/6JJ小鼠更易形成CPP[11]，提示D3R对AM成瘾所导致的免疫功能损害具有一定的保护作用。
　　
　　BESSER和LEVITE等[1213]通过体外研究发现，D2R受体抑制剂使IL10分泌下降，D3R受体抑制剂对IL10的分泌没有影响，D3R、D2R和D5R激动剂都能明显升高IL10的分泌，提示多巴胺对免疫细胞分泌IL10的作用是通过D2R而不是D3R实现的。这与本实验的结果似乎存在不一致性。由于研究方法的不同，因此产生差异的原因尚需进行进一步的探讨，但也在一定程度上显示出药物依赖对机体免疫功能影响的复杂性。

参考文献

　　[1]CONNOR TJ. Methylenedioxymethamphetamine (MDMA， Ecstasy): a stressor on the immune system [J]. Immunology， 2004， 111(4):357367.

　　[2]DEHUS O， BUNK S， von AULOCK S， et al. IL10 release requires stronger tolllike receptor 4triggering than TNF: a possible explanation for the selective effects of heterozygous TLR4 polymorphism Asp(299) Gly on IL10 release [J]. Immunobiology， 2008， 213(8):621627.

　　[3]XU M， KOELTZOW TE， SANTIAGO GT， et al. Dopamine D3 receptor mutant mice exhibit increased behavioral sensitivity to concurrent stimulation of D1 and D2 receptors [J]. Neuron， 1997， 19(4):837848.

　　[4]CONNOR TJ， HARKIN A， KELLY JP. Methylenedioxymethamphetamine suppresses production of the proinflammatory cytokine tumor necrosis factorα independent of a βadrenoceptormediated increase in interleukin10 [J]. J Pharmacol Exp Ther， 2005， 312(1):134143.

　　[5]GOMEZFLORES R， WEBER RJ. Inhibition of interleukin2 production and downregulation of IL2 and transferrin receptors on rat splenic lymphocytes following PAG morphine administration: a role in natural killer and T cell suppression [J]. J Interferon Cytokine Res， 1999， 19(6):625630.

　　[6]KUBERA M， FILIP M， BASTAKAIM A， et al. The effect of amphetamine sensitization on mouse immunoreactivity [J]. J Physiol Pharmacol， 2002， 53(2):233242.

　　[7]SIEGMUND B， EIGLER A， HARTMANN G， et al. Adrenaline
enhances LPSinduced IL10 synthesis: evidence for protein kinase Amediated pathway [J]. Int J Immunopharmacol， 1998， 20(13):5769.

　　[8]雷志明， 魏雪涛， 张坚， 等. 吗啡对小鼠免疫功能的影响[J].卫生毒理学杂志，1999， 13(1):3839.

　　[9]CONNOR TJ， KELLY JP， Leonard BE. An assessment of theacute effects of the serotonin releasers methylenedioxymethamphetamine， methylenedioxyamphetamine and fenfluramine on immunity in rats [J]. Immunopharmacology， 2000， 46(3):223235.

　　[10]FAUCHEY V， JABER M， CARON MG， et al. Differential regulation of the dopamine D1， D2 and D3 receptor gene expression and changes in the phenotype of the striatal neurons in mice lacking the dopamine transporter [J]. Eur J Neurosci， 2000， 12(1):1926.

　　[11]朱俊艳， 陈利萍， 李林，等. 多巴胺D3受体对安非他明诱导的条件性位置偏爱小鼠的作用 [J]. 法医学杂志， 2007， 23(6):428430.

　　[12]BESSER MJ， GANOR Y， LEVITE M. Dopamine by itself activates either D2， D3 or D1/D5 dopaminergic receptors in normal human Tcells and triggers the selective secretion of either IL10， TNFalpha or both [J]. J Neuroimmunol， 2005， 169:161171.

　　[13]LEVITE M， CHOWERS Y， GANOR Y， et al. Dopamine interacts directly with its D3 and D2 receptors on normal human T cells， and activates β1 integrin function [J]. Eur J Immunol， 2001， 31(12):35043512.