不同年龄段大鼠脂肪间充质干细胞生物学特性的研究

　　　　 作者：枟涛，秦书俭，王超，单伟

【摘要】 目的 观察不同年龄段大鼠脂肪间充质干细胞(adiposederived stromal cells， ADSCs)生物学特点与年龄的关系，为临床寻找理想的种子细胞并迅速获取所需ADSCs提供实验依据。方法 使用密度梯度离心法分离不同年龄段脂肪间充质干细胞进行培养，保留贴壁细胞传代，分析脂肪间充质干细胞的纯度，观察细胞生长情况，检测其增殖活性、细胞周期。结果 不同年龄段ADSCs均贴壁生长，呈典型ADSCs形态和生长特征，传代细胞的增殖速度比原代细胞快，但随着年龄的增长，原代及传代培养ADSCs的增殖能力下降，生长周期延长。结论 ADSCs的增殖能力和活性随着年龄的增长而降低，但各年龄段ADSCs均可满足临床不同患者组织工程种子细胞的要求。

【关键词】 脂肪间充质干细胞；年龄；大鼠；细胞培养；增殖

　　ABSTRACT: Objective To investigate biological characteristics of rat adiposederived stromal cells (ADSCs) of different ages. Methods ADSCs were isolated by density gradient centrifugation from different age stages， and cultured in vitro. The adherent cells were preserved to passage， the purity of ADSCs was analyzed by immunocytochemistry method， and cell growth was observed， then proliferation capability and cell cycle were detected. Results All the ADSCs obtained from different age stages grew well and showed good morphology and growth characteristics. The proliferation rate of passage cells was higher than that of primary cells， but the proliferation activity reduced with aging， and cell cycle was prolonged. Conclusion The proliferation capability and activity of ADSCs decreased with aging. However， ADSCs of different age stages can all meet the needs of different patients for tissue engineering seed cells.

　　KEY WORDS: adipose derived stem cell; age; rat; cell culture; proliferation

组织工程的兴起和迅猛发展为临床修复重建带来了新的治疗途径，成为目前最有前景的生理性修复技术[12]。种子细胞的选择是组织工程的基础和关键之一。2001年ZUK等[3]通过脂肪抽吸术获得脂肪间充质干细胞(adiposederived stromal cells， ADSCs)。ADSCs具有来源丰富、易于获取、自体移植可以避免排斥反应以及许多伦理问题等优点。大量研究发现，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs)的含量、质量以及活性随着年龄的增长而下降[4]。但是不同年龄的ADSCs在体外生长及增殖能力是否具有差异，是否能够满足临床修复的需要?ADSCs能否成为组织工程新的最理想的种子细胞?本研究旨在探讨不同年龄阶段ADSCs的生长增殖能力及其机制，为ADSCs的体外培养及临床应用提供依据。

1 材料与方法

　　1.1 主要试剂 DMEM、胎牛血清(Gibco)、Ⅰ型胶原酶(Sigma)、EDTA、MTT(Amerison)、CD34、CD44、CD49d、CD106(Sigma)。

　　1.2 实验动物分组 健康SD大鼠，雌雄不限，按月龄分为幼年组(1月龄)、成年组(12月龄)和老年组(24月龄)。体重分别约为150、400、750g。

　　1.3 ADSCs的分离培养及传代 取SD大鼠，脱颈处死，消毒，无菌条件下取腹股沟部及肾下1g脂肪组织，去除其他组织，用PBS冲洗3次，将脂肪组织剪成大约1mm3小块，置2g/LⅠ型胶原酶中，消化60min，然后1000r/min，离心10min，弃上清，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液，计数，接种于培养瓶中，常规培养。待细胞融合达80%时1∶2传代、扩增培养。

　　1.4 细胞形态学观察 每日在倒置显微镜下观察原代及传代细胞的生长情况以及形态特点。

　　1.5 ADSCs表面标记的检测 取第3代的ADSCs，分为4份，分别滴加兔抗鼠CD34、CD44、CD49d、CD106一抗，4℃反应30min后，PBS洗涤2次，滴加异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗兔IgG，避光固定，经流式细胞仪检测细胞表面CD34、CD44、CD49d、CD106阳性细胞的表达。将第3代ADSCs多聚甲醛固定后，免疫细胞化学方法染色鉴定。

　　1.6 ADSCs生长周期的测定 取第3代细胞达80%融合时消化制成细胞悬液，滴入4℃预冷的700mL/L乙醇中固定30min，PBS漂洗离心，RNAseA处理30min，离心，加入碘化丙啶0.5mL，4℃避光染色30min，流式细胞仪488nm检测。

　　1.7 绘制ADSCs的生长曲线 取各年龄组ADSCs以1×104/mL的密度接种于96孔培养板内，每孔200μL，常规培养。每天同一时间随机抽取6孔细胞，加入50g/L MTT 20μL/孔，培养4～6h，DMSO震荡10min，酶联免疫测定仪测定波长490nm处的吸光度。取6孔吸光度的均值，以时间(d)为横坐标，吸收值(A)为纵坐标，绘制生长曲线。

　　1.8 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。所有数据采用±s表示。组间比较采用单因素方差分析，方差不齐组经数据转换后再进行方差分析；各组细胞生长曲线用重复测量的方差分析(Repeatedmeasures ANOVA)。P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有非常显著性差异。

　　2 结　　果

　　2.1 细胞形态学观察

　　2.1.1 原代培养ADSCs的形态学观察 通过密度梯度离心获得的ADSCs接种后在悬液中细胞呈圆形，不能辨认细胞核，各年龄组在原代培养24h，可见细胞开始贴壁，细胞呈星形，胞体较小；培养第4天，各组细胞形态无差别，均呈梭形、多角形；幼年组细胞数量多，形成集落明显，克隆性生长(图1A)；成年组细胞数量较多，克隆性生长(图1B)；老年组细胞数量少，散在分布(图1C)。幼年组ADSCs大约5d左右达到80%细胞融合基本铺满瓶底，成年组和老年组ADSCs分别需要6、8d左右才可以达到80%细胞融合，进行传代。

　　2.1.2 传代培养ADSCs的形态学观察 各年龄组均呈现特征性生长模式，传代培养的ADSCs生长模式与原代培养细胞相似，但细胞增殖速度比原代明显加快(图2)，幼年组、成年组、老年组细胞分别为3、4、5d左右传代，ADSCs多呈短梭形。

　　2.2 细胞表面标记检测 对各组第3代ADSCs通过流式细胞仪检测了CD34、CD44、CD49d、CD106四个细胞表面标记，各年龄组细胞表面CD44、CD49d阳性表达，免疫细胞化学染色后胞膜为棕色，阳性率均在95%以上；而CD34、CD106为阴性表达，胞膜未着色(图3)。

　　2.3 ADSCs生长周期的测定 各年龄组周期细胞所占比例见表1。老年组与成年组、幼年组相比，G0/G1期由78.77%增至88.30%；S期比例由15.23%降至8.17%，幼年组S期比例明显高于其他组，与成年组之间的差异有显著性意义(F0.05(1，27)=4.21<5.43，P<0.05)，与老年组之间的差异有非常显著性意义(F0.01(1，27)=7.68<78.23，P<0.01)。

　　2.4 ADSCs的生长曲线 各年龄组的细胞生长曲线呈S型。接种后1～2d为滞留期，第3天左右达对数生长期，第6～7天达到最高峰，此后出现生长抑制状态，进入平台期，数目不再增长。年龄越小细胞增殖速度越快，幼年组高峰值明显大于其他组，但与老年组之间的差异无统计学意义(图4)。图4 不同年龄段ADSCs的生长曲线

3 讨　　论

　　组织工程中种子细胞的选择至关重要。目前，主要的种子细胞有以下几种：胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞等。胚胎干细胞虽然可以定向诱导分化为各种组织细胞，但是存在伦理问题，限制了其实际应用[5]。一般认为BMSCs是组织工程理想的种子细胞之一，但即使在骨髓中，MSCs的含量也很低，每105～106个单核细胞中大约含一个MSCs，并且随着增龄，MSCs含量逐渐减少[6]，并且骨髓穿刺给患者造成较大的创伤和痛苦，而且采集量有限，每个成人只能抽取10～20mL骨髓，因此不利于临床大规模的培养与应用。脐血间充质干细胞来源有限且分离困难，临床应用潜力较小。ADSCs证实其具有分化为多种中胚层来源细胞的潜能[7]，由于人体脂肪量较多约占体重的13%，所以ADSCs的来源十分丰富，并且自体移植可以避免排斥反应以及许多伦理问题。

　　本实验中各年龄阶段SD大鼠均能培养出ADSCs，各组细胞均呈梭形或不规则形。幼年组和成年组细胞胞体较小、集落形成较密集、形态规则、细胞密度大；老年组细胞较大并且稀疏、呈散在分布、供体形成集落小、少，幼年组以及成年组细胞提取数量明显高于老年组。

　　本研究中ADSCs表面表达CD44、CD49d阳性；而CD34、CD106为阴性表达。CD34作为造血干细胞标志性免疫表型，CD34阴性说明ADSCs并非来源于血液循环中的干细胞，同时说明ADSCs未受到脂肪组织中微血管内皮细胞的污染。有研究显示ADSCs与BMSCs都可表达CD44[8]。CD49d在ADSCs中为阳性表达，在BMSCs中则为阴性表达；而与CD106相反；本实验CD106阴性表达，已经排除BMSCs污染的可能。以上结论说明已经得到纯度较高的ADSCs。CD49d是调节造血干细胞和祖细胞定居归巢到骨髓的表面分子，CD106是调节造血干细胞和祖细胞从骨髓中向外迁移的表面分子，CD49d与CD106是ADSCs与BMSCs很好的区别标记，但其本质有待进一步的研究。

　　不同年龄阶段的ADSCs在细胞周期各时相中的分布趋势为G0+G1期>S期>G2+M期，说明从幼年、成年一直到老年，大多数ADSCs处于G0+G1静止期，各组细胞随供体年龄增加，G0+G1静止期百分比例不断增加，说明衰老使机体内处于静止的ADSCs数量不断增加；S期的细胞比例反映了细胞的增殖程度，幼年组细胞处于S期的百分比例大于其他组，与其他组有显著性差异，呈现随年龄增长而增殖期细胞减少的趋势，说明随着机体的不断衰老，干细胞增殖能力也在不断减弱。

　　体外培养的ADSCs经历生长滞缓期、对数增殖期和平台期，生长曲线呈S形，这符合干细胞的生长特性。各组均在3d左右出现倍增，7d左右达到增殖高峰，7d以后由于细胞已经基本长满瓶底，出现接触抑制现象，细胞生长反而相对缓慢。由生长曲线可以看出随供体年龄的增长，细胞的增殖能力和活性相应减弱。各年龄段ADSCs均可稳定传至9代，按支架接种细胞数106～107的要求[9]，经过传代培养后各年龄段的ADSCs的数量均可满足临床需要，但是应充分考虑不同年龄段供体脂肪的抽取量以及种子细胞的扩增时间与病情的需要。

　　综上所述，明确了各年龄段从脂肪组织均可获得ADSCs，并保持稳定增殖力，不同年龄组经过传代能够使ADSCs相对纯化，并且扩增数量能满足临床应用的需要，但应考虑年龄对ADSCs增殖的影响。本实验证实ADSCs能够成为组织工程中新的理想的种子细胞，并为ADSCs的临床应用提供了依据。

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