甲胎蛋白对人肝癌Bel 7402细胞caspase信号传递及耐受TRAIL的影响

　　　　 作者：李孟森，詹志农，周升，刘新华，李刚

【摘要】 目的 研究甲胎蛋白(AFP)对人肝癌Bel 7402细胞内caspase信息通路信号传递的影响，以及对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导肝癌细胞凋亡的对抗作用。方法 激光共聚焦显微镜观察AFP与caspase3、caspase8 在Bel 7402细胞内的共定位；免疫共沉淀(CoIP)技术研究AFP与caspase3、caspase8的相互作用； RNA干扰(RNAi)技术封阻AFP表达，并用Western blotting检测RNAi干扰肝癌Bel 7402细胞内AFP表达的效果；用蛋白酶活性比色法检测AFP对肝癌细胞caspase3、 caspase8活性的影响； MTT法分析干扰AFP表达30h后再给予TRAIL(2nmol/L)处理24h，Bel 7402细胞的生长情况，并用荧光显微镜观察经TRAIL处理后肝癌细胞的凋亡状况。结果 共聚焦显微镜观察发现AFP、caspase3、caspase8主要表达于Bel 7402细胞的细胞质，发现AFP能与caspase3共定位于细胞质，但与caspase8在细胞质的共定位可能性很小；CoIP技术研究发现AFP能与caspase3结合，但不能与caspase8结合；2nmol/L 剂量的TRAIL单独处理Bel 7402细胞并不能显著改变caspase3活性，但能提升caspase8活性，而用全反式维甲酸(ATRA)40μmol/L加TRAIL(2nmol/L)处理时，则能提高Bel 7402细胞caspase3活性；干扰AFP表达后，单独用TRAIL(2nmol/L)也能激活caspase3，而干扰AFP表达前后对caspase8活性没有显著性改变；MTT分析发现，2nmol/L剂量的TRAIL对Bel 7402细胞的生长并没有显著性抑制作用，但是干扰AFP表达后TRAIL(2nmol/L)能明显抑制Bel 7402细胞生长(抑制率为48.4%)；荧光显微镜观察表明，干扰AFP表达后TRAIL(2nmol/L)能诱导Bel 7402细胞凋亡。结论 AFP选择性抑制caspase3活性是阻断人肝癌Bel 7402细胞内凋亡信息传递的重要机制，也是AFP抵抗TRAIL诱导肝癌细胞凋亡的关键环节。

【关键词】 甲胎蛋白；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；肿瘤耐药；肝癌细胞；caspase信息通路

　　ABSTRACT: Objective To explore the effects of alphafetoprotein (AFP) on the transduction of apoptotic signal in hepetocellular cancinoma cells (HCC) and the role of AFP in counteracting the apoptosis induced by tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand (TRAIL) of HCC. Methods Laser confocal microscopy was applied to observe the colocalization of AFP and caspase3 or caspase8. Coimmunoprecipitation (CoIP) was utilized to analyze the interaction of AFP with intracellular apoptotic signal molecules， caspase3 or caspase8. Short small RNA interfering (siRNA) technique was used to knockdown the expression of AFP in Bel 7402 cells. AFPs effect on the activity of caspase3 or caspase8 was detected by protease activity colorimetric methods. Bel 7402 cellsSupported by the National Natural Science Foundation of China (No.30660071， 30760090， 30671856， 30772536) and the Foundation of National Education Ministry for Graduate Program of China (No.20070001735) were administered with TRAIL (2nmol/L) for 24h after knockdowning the expression of AFP by siRNA and the growth of the cells was analyzed by MTT or apoptosis of the cells was observed by fluorescence microscopy. Results AFP could interact with caspase3 in cytoplasm， but could not bind with caspase8. Treated with all trans retinoic acid (ATRA) (40μmol/L) plus TRAIL(2nmol/L) also enhanced the activity of caspase3 or caspase8， whereas treated with TRAIL(2nmol/L) alone for 24h， the activity of caspase8 was enhanced but the activity of caspase3 has not any change. AFP was able to inhibit caspase3 activity but it had little affect on the activity of caspase8 in vitro. When RNAi knockdowned the expression of AFP followed by treatment with TRAIL (2nmol/L)， the activity of caspase3 was increased， but the activity of caspase8 remained the same as knockdown before. MTT detection showed that the growth of Bel 7402 cells was inhibited， the ratio was 48.4%， and apoptosis in nuclei of Bel 7402 cells was found to be induced when observed by fluorescence microscopy. Conclusion AFP can block the transduction of apoptotic signal by selectively inhibiting the activity of caspase3， and this is also the pivotal event that AFP counteracts the apoptosis induced by TRAIL of hepatoma cells.

　　KEY WORDS: alphafetoprotein; tumor necrosis factor related apoptosisinducing ligand (TRAIL); drug resistance in cancer; hepatocellular carcinoma cell; caspase signal transduction

　　肝细胞癌是严重危害人类健康的重大疾病。我国是肝癌高发国家，由于肝炎和环境等因素的影响，肝癌有逐年上升趋势，尽管临床上多采用手术和药物(化疗)治疗肝癌，但是由于肿瘤细胞的再生和转移以及肿瘤细胞对药物的耐受，导致治疗前景暗淡，所以揭示肝癌耐药的分子机制，将给肝肿瘤治疗带来新的希望。甲胎蛋白(alphafetoprotein， AFP)是肝癌细胞合成的特异性很高的蛋白质，很多肝癌患者(70%～80%)在发病期间都有AFP基因高表达的特征。AFP是一种胚原蛋白，其基因在胎儿发育过程开放表达，而在人出生两年后基本处于关闭状态，但是成人发生肝癌或肝脏良性再生时，AFP的基因重新被激活而大量表达，AFP在临床上被认为是肝癌的经典肿瘤标记物，因而AFP被用作诊断肝癌的金标准。已经有大量研究证明肝癌细胞分泌的AFP具有促进肿瘤细胞增殖[15]和诱导肿瘤细胞凋亡[69]的双重作用。肝癌细胞在体内生存，必须逃避机体的免疫监控，耐受淋巴细胞等分泌的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF)家族诱导凋亡。尽管已有研究发现AFP具有促进肿瘤细胞增殖和对抗TNF家族诱导凋亡[4，1011]，但对肝癌细胞分泌的AFP在肝癌细胞耐受凋亡诱导过程中的具体作用知之甚少。在体内生理浓度的AFP能促进肝癌细胞生长，肝癌细胞也由于分泌AFP而能抑制淋巴细胞的攻击和诱导淋巴细胞凋亡，从而逃避免疫监视[1012]。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF relatedapoptosis inducingligand， TRAIL)被认为是很有开发前景的抗肿瘤的细胞因子[1314]，TRAIL能通过与死亡受体(TRAIL受体)结合，激发caspase信号通路的级联反应而发挥其诱导肿瘤细胞凋亡作用，因而阻断caspase信号传递是肿瘤细胞耐受TRAIL或全反式维甲酸(all trans retinoic acid， ATRA)等化学药物诱导凋亡的重要方式[1415]。作为肝癌细胞合成的特异性很高的蛋白质，AFP在对抗细胞因子和化学药物等诱导凋亡中的作用及是否为肝癌细胞抗凋亡诱导的重要物质等问题，是认识肝癌细胞发生过程中为何高表达AFP的核心环节。本研究分析AFP在人肝癌Bel 7402细胞内对caspase3、caspase8活性的影响，探索AFP对凋亡信号传递的调控作用及其对抗TRAIL诱导凋亡的一些分子机制。

1 材料与方法

　　1.1 细胞系和蛋白质材料 人肝癌Bel 7402细胞由北京大学医学部细胞生物学系提供；AFP纯品(code：A32260H，从肝癌细胞中提取)购自Biodesign 公司；重组人的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor relatedapoptosis inducingligand， TRAIL/Apo2L，code: 31004)购自PeproTech EC. LTD(USA)；小鼠抗人AFP的单克隆抗体(code: T2)和兔抗人caspase3(code: 50)多克隆抗体购自Perfe Scientific公司(USA)，小鼠抗人Actin(code: sc1616)单克隆抗体、Western blotting luminol reagent(code: sc2048)购自Santa Cruz公司(California， USA)；兔抗人caspase8多克隆抗体(code: MS1143P0)为Lab Vision Corporation(USA)产品；二抗为辣根过氧化物酶连接的羊抗小鼠、羊抗兔多克隆抗体、FITCconjugated(code: 66288) 羊抗兔和TRITCconjugated(code: 61551) 羊抗小鼠二抗为Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc(Baltimore， PA， USA)的产品；RNA干扰试剂盒pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector Kit (code: E07/F07)购自上海吉玛制药技术有限公司；All trans retinoic acid (ATRA，code: 98F0178)为Sigma产品。

　　1.2 细胞培养 用含有100mL/L小牛血清的RPMI1640培养基(GIBCOBRL公司产品)培养人肝癌Bel 7402细胞，待细胞长到90%融合时，用2.5g/L的胰蛋白酶消化细胞，100mL/L小牛血清的RPMI1640培养基吹散细胞，把细胞调整到一定的数目，进行以下的实验研究。

　　1.3 激光共聚焦显微镜技术研究蛋白质的细胞内定位 20mm×20mm的盖玻片经过洁净处理，高温、高压消毒后放置到6孔细胞培养板中，然后加入用RPMI1640(含有100mL/L胎牛血清)调整到2.0×104个/mL的细胞悬液2mL，待细胞长到70%融合，用40g/L多聚甲醛固定细胞30min，再用3mL/L的TritonX 100浸泡细胞30min，去掉全部液体，用1mL PBS清洗细胞3次，去掉全部液体，用50mL/L的胎牛血清封闭细胞1h，去掉封闭液，加入小鼠抗人AFP的单克隆抗体(抗体浓度为1∶100)和兔抗人caspase3或caspase8的多克隆抗体(抗体浓度为1∶100)，4℃轻摇12h，去掉一抗液体，用1mL PBS清洗细胞3次，加入TRITC标记的羊抗小鼠二抗和FITC标记的羊抗兔二抗液1mL(PBS配制)，室温轻摇2h(避光)，再加入10μL浓度为100μg/mL DAPI(终浓度为10μg/mL)，室温轻摇30min(避光)，去掉全部液体，用1mL PBS清洗细胞3次，用Olympus Fluoview FV1000(Japan)型激光共聚焦显微镜观察标记结果并分析荧光分子在细胞内共定位、拍摄图像。

　　1.4 免疫共沉淀技术分析蛋白质相互作用 Bel 7402细胞用RPMI1640(含100mL/L胎牛血清)调整到2.0×104个/mL，5mL细胞液培养于33cm2的培养瓶，每组设2个平行瓶，细胞培养24h后，去掉培养液，换成含有100mL/L血清和含有ATRA(40μmol/L)加TRAIL(2nmol/L)浓度的RPMI1640处理细胞24h，提取细胞蛋白质，蛋白质分4份，其中1份做Input，剩下的3份分别用抗AFP单克隆抗体、caspase3或caspase8的单克隆抗体和兔免疫血清(IgG)沉淀目标抗原，然后用protein Aagarose(碧云天生物科技研究所产品，江苏)把抗原抗体复合物吸附到agarose珠子上，并离心清洗其他蛋白质，再用上样缓冲液和高温煮沸方法使agarose珠子与蛋白质复合物分离，经过SDSPAGE(聚丙烯酰氨凝胶电泳)把抗原和抗体分离，Western blotting杂交分析相关抗原，用FUJI 公司(Japan)LAS3000型化学发光/荧光仪拍摄杂交蛋白质条带。

　　1.5 RNA干扰技术封阻AFP表达和Western blotting检测干扰效果 ①20mm×20mm的盖玻片经过洁净处理，高温、高压消毒后放到6孔培养板中，然后加入用RPMI1640(含有100mL/L胎牛血清)把Bel 7402细胞调整到2.0×104个/mL的细胞悬液2mL，待细胞长到70%～80%融合，转染已经构建有siRNAAFP序列的pGPU6/GFP/Neo质粒，干扰AFP的三个序列分别为：序列1 Sense: GTTG AATG CTTC CAAA CAA， Antisense: TTGT TTGG AAGC ATTC AAC(称为AFP 593siRNA)，序列2 Sense: GCAG CTTG TTAA ATCA ACA；Antisense: TGTT GATT TAAC AAGC TGC(称为AFP645siRNA)；序列3 Sense: GAAC GTGG TCAA TGTA TAA；Antisense: TTAT ACAT TGAC CACG TTC(称为 AFP 923siRNA)；阴性对照序列Sense: GTTC TCCG AACG TGTC ACG；Antisense: ACGT GACA CGTT CGGA GAA(称为 NCVector)。用LipofectamineTM 2000 (Invitrogen 公司产品)促进转染，待转染12h后，去掉全部液体，用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养细胞18h后，取出盖玻片，置于载玻片上，用荧光显微镜观察转染效率。②Bel 7402细胞用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640调整到2.0×104个/mL，5mL细胞液培养于33cm2的培养瓶，每组设2个平行瓶，待细胞培养70%～80%融合后，转染已经构建有siRNAAFP序列的pGPU6/GFP/Neo质粒，用LipofectamineTM 2000促进干扰载体转染细胞，待转染12h后更换新的培养液再培养细胞18h，按Western blotting杂交分析方法提取细胞蛋白质并分析AFP表达。

　　1.6 蛋白酶活性比色法分析caspase3和caspase8活性

　　1.6.1 细胞外的AFP对人肝癌Bel 7402细胞内caspase3和caspase8活性的影响 人肝癌Bel 7402细胞按1.0×105个/mL，培养于33cm2培养瓶中，每组设3个平行瓶，每瓶5mL，待细胞长到70%～80%融合，饥饿细胞(用不加血清的培养液)24h后换成含100mL/L小牛血清的培养液培养12h，加入TRAIL(2nmol/L)和ATRA(40μmol/L)共同处理24h后，收集细胞，按测定caspase3活性试剂盒(APOPCYTO caspase3 Colorimetric Assay Kit，Medical & Biological Laboratories CO.， LTD， Japan)和caspase8活性测定试剂盒(caspase8 Colorimetric Activity Assay Kit， Chemicon International， Inc， CA， USA)的操作说明裂解细胞，提取蛋白质。即经过药物处理后的人肝癌细胞，用试剂盒提供的细胞裂解缓冲液提取细胞内的蛋白质，考马斯亮蓝法测定蛋白含量，蛋白质浓度调整到2～3mg/mL，把相同蛋白量加到96孔平底酶标板(或细胞培养板)，每组设3个平行孔，然后按照要求加入相应的反应底物、AFP纯品(先与提取的蛋白酶在4℃混合30min，AFP的终浓度为1μg/mL)、抗AFP的单克隆抗体(mAb，终浓度为2μg/mL)、酶活性抑制物等，充分混匀，避光置于37℃保温3～6h。

　　1.6.2 细胞内的AFP对人肝癌Bel 7402细胞caspase3和caspase8活性的影响 Bel 7402细胞用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640调整到2.0×104个/mL，5mL细胞液培养于33cm2的培养瓶，每组设3个平行瓶，待细胞培养70%～80%融合后，转染已经构建有siRNAAFP序列的pGPU6/GFP/Neo质粒，用LipofectamineTM 2000促进干扰载体转染细胞，待转染12h后更换新的培养液再培养细胞18h，再用TRAIL(2nmol/L)处理12h，TRAIL(16nmol/L)作为阳性对照组，按检测caspase3和caspase8活性试剂盒的说明裂解细胞，提取蛋白质，并按以上测定caspase3、caspase8活性的方法分组，加入酶反应底物或抑制物，避光37℃孵育3～6h后，用BioTek Instruments 酶标仪在波长405nm测光密度(A405)。酶相对活性=(对照组A405-处理组A405)/ 对照组A405×100%。

　　1.7 MTT法检测干扰AFP表达后Bel 7402 细胞对TRAIL的敏感性 Bel 7402细胞被转染AFPsiRNA载体30h后，2.5g/L胰蛋白酶消化细胞，再用含有100mL/L小牛血清的RPMI1640培养液吹散细胞，调整细胞数目为2.5×104个/mL，培养于96孔培养板中，每孔120μL，每组设8个平行孔，适应培养24h后，细胞被饥饿12h(用不加血清的培养液)，换成含100mL/L小牛血清的培养液培养12h，加入各种浓度的TRAIL(2、16nmol/L)，处理24h后，每孔加入16μL的MTT(5g/L)，37℃孵育4h，去掉所有的液体，用PBS(pH 7.4)液洗3次后，去掉PBS液，每孔加入120μL二甲基亚砜，微震荡仪震荡30min，酶标仪570nm测吸光度(A)。A值越大表示细胞生长越旺盛。

　　1.8 DAPI染色检测干扰AFP表达后TRAIL诱导Bel 7402 细胞凋亡 用含有100mL/L胎牛血清的RPMI1640把Bel 7402细胞调整到2.0×104个/mL，2mL细胞悬液培养于6孔细胞培养板中，待细胞长到80%融合，Bel 7402细胞被转染已经构建有AFP923siRNA序列的pGPU6/GFP/Neo质粒，待转染30h后加入TRAIL(2、16nmol/L)处理24h后，然后收集悬浮细胞到离心管，再用2.5g/L胰蛋白酶消化贴壁细胞，用1.5mL PBS把细胞轻轻吹下，收集到装有悬浮细胞的离心管中，离心(1000r/min， 5min)，去掉PBS，用1mL PBS把细胞轻轻吹散，加入10μL浓度为100μg/mL DAPI，避光37℃保温30min，离心(1000r/min， 5min)，去掉上清液，加入1mL PBS把细胞轻轻吹散，离心(1000r/min， 5min)，清洗细胞3次，去掉上清液，加入100μL PBS把细胞吹散，吸出20μL细胞悬液加到干净的载玻片上，再轻轻压上盖玻片，静置5min后，用荧光显微镜观察细胞凋亡小体，并显微拍摄图像。

　　1.9 统计学处理 所有需要统计学处理的数据，数值取±s，用Excel软件，实验组之间数据用t检验。P<0.05表示组间数据有统计学意义。

2 结　　果

　　2.1 Bel 7402细胞内AFP与caspase3、caspase8的细胞共定位 共聚焦显微镜观察发现，AFP和caspase3、caspase8的表达主要定位于Bel 7402细胞质和细胞核周围；共定位分析发现AFP和caspase3的共定位可能性很大(图1A)，但是AFP和caspase8的共定位可能性很小(图1B)。

　　2.2 AFP 在Bel 7402细胞内与caspase3、caspase8的相互结合 免疫共沉淀技术(CoIP)研究发现，在Bel 7402细胞内，AFP能与caspase3相互作用(图2A)，但是AFP没有与caspase8相互结合的特性(图2B)；当用ATRA(40μmol/L)和TRAIL(2nmol/L)联合处理24h后，AFP与caspase3相互结合现象消失(图2A)；药物处理后也未能改变AFP不能与caspase8相互结合的特性(图2B)。

　　2.3 细胞外的AFP对caspase3和caspase8活性的影响 ATRA(40μmol/L)和TRAIL(2nmol/L)联合处理Bel 7402细胞24h后，用细胞裂解液提取全细胞蛋白酶液，用蛋白酶液测细胞内caspase3和caspase8活性，结果显示，caspase3(图3A)和caspase8(图3B)活性都有显著的升高，与对照组比较caspase3升高1088%(图3A)，caspase8则升高169%(图3B)；而当在蛋白酶液中加入 AFP(终浓度为1μg/mL) 并在4℃混合30min(或室温10min)后，再加入caspase3或caspase8的反应底物，在相同的反应条件下测酶活性则发现AFP在细胞外能抑制caspase3活性(图3A)，但是对caspase8的活性没有明显的影响(图3B)，用抗AFP的单克隆抗体(mAb，终浓度为2μg/mL)先和AFP在4℃混合30min(或室温10min)后再行以上实验，则发现AFP的单克隆抗体能中和AFP的作用，即消除AFP对caspase3活性的抑制作用(图3A)。

　　2.4 转染RNA干扰载体后对AFP表达的干扰效果 Bel 7402细胞被转染构建siRNAAFP序列的pGPU6/GFP/Neo质粒(分别转染3个片段的干扰载体)30h后，用荧光显微镜观察干扰载体的转染效果(图4A、4B)，3个siRNA载体转染效率都很高，用Western blotting分析干扰载体对Bel 7402细胞的AFP表达的抑制作用，结果显示，干扰效果最强的是923序列，645序列次之，593序列干扰效果最弱(图4C)，所以就选择干扰载体923(命名为AFP923siRNA)进行后面的实验。

　　2.5 干扰AFP表达对肝癌细胞内caspase3和caspase8活性的影响 Bel 7402细胞被转染AFP923siRNA(siRNAAFP)载体30h后，再用TRAIL(2nmol/L)处理24h，按caspase活性分析试剂盒操作说明提取细胞酶蛋白液并检测Bel 7402细胞内caspase3和caspase8活性，结果显示，AFP能显著抑制caspase3活性，而对caspase8活性则没有显著性影响；单独干扰AFP表达对这两种酶的活性没有显著性影响；干扰AFP表达前，用TRAIL(2nmol/L)处理并不能提升Bel 7402细胞caspase3的活性，但是却能提高caspase8活性；当转染构建siRNAAFP序列载体30h后再用TRAIL(2nmol/L)处理24h，则能提高caspase3的活性，与对照比较上升563%，而对caspase8活性的影响在干扰AFP表达前后没有明显的变化(图5)。

　　2.6 肝癌细胞内表达的AFP对抗TRAIL诱导肝癌细胞凋亡作用 MTT法分析显示，单独采用干扰AFP或TRAIL(2nmol/L)处理Bel 7402细胞24h，并没有明显抑制肿瘤细胞生长，当转染构建siRNAAFP序列的pGPU6/GFP/Neo质粒(AFP923siRNA)30h后，再用TRAIL(2nmol/L)处理Bel 7402细胞24h，则发现TRAIL能明显抑制Bel 7402细胞生长，抑制率达48.4%，大剂量的TRAIL(16nmol/L)能直接抑制肝癌细胞生长(图6B)。荧光显微镜观察显示，单独采用干扰AFP或TRAIL(2nmol/L)处理Bel 7402细胞24h，并不能明显诱导Bel 7402细胞凋亡，当转染构建siRNAAFP序列的pGPU6/GFP/Neo质粒(AFP923siRNA)30h后，再用TRAIL(2nmol/L)处理24h，则发现TRAIL能诱导Bel 7402细胞凋亡，荧光显微镜下能观察到凋亡小体形成；大剂量的TRAIL(16nmol/L)能直接诱导肝癌细胞凋亡，镜下也能观察到凋亡小体形成(图6A)。

　　3 讨　　论

　　在体内淋巴细胞分泌一定含量的TRAIL，TRAIL在血液中循环，当遇到非正常细胞(肿瘤细胞、衰老的血细胞等)时，TRAIL与其受体结合[1618]，激动caspase8等一系列信号的级联反应，把凋亡信息传递到凋亡的执行者caspase3，活化的caspase3进入细胞内裂解PARP1，并活化，切断胞核内的染色体，启动程序性细胞死亡。已经有研究证明肝癌细胞能耐受TNFα[19] 和TRAIL的作用与AFP的高表达有关[20]，而肝癌细胞耐受凋亡诱导是肝肿瘤难治的主要原因。肝癌细胞耐受TRAIL等TNF家族成员的作用，可能的原因很复杂，但是肝癌细胞高表达AFP被认为是维持肝癌细胞在体内得以生存的重要因子，因而AFP在细胞内的作用靶分子是需要重点研究的对象。

　　TRAIL与其受体DR5结合后通过caspase的级联反应传递凋亡信号，但是在Bel 7402细胞有高表达的AFP，AFP能促进肿瘤细胞增殖，也就是具有对抗凋亡诱导作用。AFP是否能阻断caspase信号的级联反应?有研究表明AFP在细胞外能与凋亡复合体结合，并把caspase3和Apaf1募集到复合体中，置换出细胞凋亡蛋白抑制子(cellular inhibitor apoptosis protein)cIAP2，而且AFP能与XIAP结合，促使caspase3与XIAP分离，导致caspase3活化[2122]，也就是说AFP具有与信号物质结合的特性。本研究采用CoIP法分析AFP与凋亡信息分子caspase3/8的结合情况，结果显示，人肝癌Bel 7402细胞在没有任何药物处理时(即自然培养的情况下)，细胞内合成的AFP能与caspase3结合，但是却没有表现出与caspase8结合的特性，当用ATRA和TRAIL联合处理细胞时，则能导致AFP与caspase3分离，而对AFP不能与caspase8结合的特性没有明显影响；我们前期研究发现，单独用小剂量的ATRA(40μmol/L)或TRAIL(2nmol/L)并不能激活caspase3，但是这两者联合使用则能导致PARP1断裂，而且发现ATRA(40μmol/L)能促进Bel 7402细胞的DR5表达[23]；共聚焦显微镜观察发现AFP能与caspase3共定位于细胞质，而AFP与caspase8共定位的可能性很小，也就是说不管是用CoIP法或共聚焦显微镜观察均能说明AFP能选择性与caspase3结合。

　　尽管AFP能与caspase3结合，但是对caspase3的活性是否有影响?我们分析细胞外的AFP对Bel 7402细胞caspase3/8活性的影响，先用ATRA和TRAIL联合处理Bel 7402细胞24h后，再检测caspase3/8活性，发现这两种酶的活性明显升高，特别是caspase3升高的幅度最大(与对照组比较大于10倍)，当用从肝癌细胞中提取的AFP与酶蛋白液混合后再测caspase3/8活性，发现AFP对caspase3活性有明显抑制作用。令人惊奇的是，AFP不能抑制caspase8的活性，也就是说，在细胞外AFP能选择性的抑制caspase3活性，而对caspase8活性则没有影响。细胞外的AFP能抑制caspase3活性，而肝癌Bel 7402细胞内的AFP是否也有相似的功能?本实验结果表明，Bel 7402细胞内高表达AFP，所以我们采用RNA干扰技术抑制AFP表达，再观察caspase3/8活性的变化。RNAi采用的3个干扰序列封阻AFP表达，发现序列AFP923的干扰效果最明显，所以就用AFP923序列行干扰实验。本研究结果显示，单独干扰AFP表达，并不能改变Bel 7402细胞内的caspase3/8活性；RNA干扰AFP表达前用TRAIL(2nmol/L)处理，并不能引起caspase3活性升高，但是却能诱导caspase8活性；而干扰AFP表达后，TRAIL能激活caspase3，但干扰AFP表达前后caspase8活性并没有明显改变。这些结果提示，AFP阻断caspase信号传递的作用位点在caspase3，在没有细胞外凋亡信号激动时，即使干扰AFP表达也不能激活caspase信号级联反应，研究结果证明AFP阻断凋亡信号传递，其作用类似于survivin，即只选择性影响caspase3活性。我们前期研究发现ATRA能抑制AFP表达，但能促进DR5表达，单独的ATRA和TRAIL并不能激发caspase活性，可能的机制是尽管ATRA能上调肝癌细胞表达DR5[23]，但是却缺乏与DR5结合的配体，因而无法激动受体的信号传递；而TRAIL单独处理，肝癌细胞膜上的DR5量很少，还不能达到激动受体级联反应的信息数量，或者尽管有配体与DR5结合但是由于caspase信号传递受阻，所以ATRA和TRAIL的联合处理就产生这样的效果：ATRA与其受体结合后，受体起转录调节因子作用，其作用的结果是上调肝癌细胞DR5的表达，增加了TRAIL与肝癌细胞膜上DR5的结合，激活caspase信号，同时也可能是ATRA下调AFP的表达，导致caspase信号通路的顺畅。从细胞凋亡分析发现，TRAIL和ATRA有协同诱导人肝癌Bel 7402细胞凋亡的特性，从另一个侧面证明，ATRA上调DR5的表达，增加Bel 7402细胞对TRAIL的敏感。TRAIL是通过caspase的级联反应而起诱导细胞凋亡作用，caspase3是capase信号途径的最终执行者，其激活是由上游的caspase6、caspase8、caspase10等蛋白酶传递完成的[2628]，caspase3活性被激发是启动程序性细胞死亡的重要环节，因而AFP抑制caspase3活性是人肝癌Bel 7402细胞耐受TRAIL诱导凋亡的重要分子机制。

　　AFP能抑制caspase3活性，那么AFP是不是肝癌细胞耐受TRAIL的主导因子?前期研究发现，细胞外的AFP能对抗TNF和TRAIL的作用，小剂量的TRAIL(2nmol/L)能轻微诱导Bel 7402细胞凋亡[20]，然而并不清楚肝癌细胞内表达的AFP通过何种机制耐受TRAIL。本研究发现，单纯抑制AFP表达，并不能阻止肝癌Bel 7402细胞生长，但是干扰AFP表达却能提高肝癌Bel 7402细胞对TRAIL的敏感性，并且发现小剂量的TRAIL(2nmol/L)能明显诱导7402细胞凋亡。TRAIL通过与其受体DR5结合激发caspase信号轴而发挥诱导凋亡作用，肝癌Bel 7402细胞内高表达的AFP能与细胞内caspase3结合并抑制其活性，阻断凋亡信号传递到细胞核。这些结果提示，Bel 7402细胞内表达的AFP是肿瘤细胞抗凋亡诱导作用的重要因子。已有研究发现，合成的维甲酸能促进DR5的表达导致肿瘤细胞对TRAIL敏感[24]，也就是说ATRA和TRAIL联合应用能增加肿瘤细胞与TRAIL的亲和力，本研究用ATRA抑制AFP表达或通过干扰AFP表达都能引起Bel 7402细胞对TRAIL敏感性，提示AFP是Bel 7402细胞耐受TRAIL的重要因子。AFP与肿瘤细胞的恶性度、侵袭等密切相关[25]，AFP通过抑制肿瘤细胞TNF受体的信号传递而导致肝癌细胞在体内恶性生长[26]，因而高表达AFP的肿瘤患者临床治疗效果和预后都很令人沮丧[2730]。研究显示，抑制肝癌细胞AFP的RNA表达能阻止癌细胞生长[31]，下调AFP表达也能特异诱导AFP阳性的Bel 7402细胞凋亡[32]，这些结果表明，AFP与肝肿瘤细胞的恶性生长密切相关。肿瘤患者淋巴细胞均表达一定数量的TRAIL，尽管肝癌细胞低表达TRAIL受体(DR5)[3334]，但是体内的TRAIL也能与癌细胞表面的DR5结合而激动凋亡信号。本研究结果显示，小剂量TRAIL也能引起caspase8活性升高，但是却不能激活caspase3，可能的机制是，AFP能选择性与caspase3结合并抑制caspase3的活性，直接阻断caspase信号通路的级联反应；肝癌细胞内高表达AFP有利于细胞内survivin的表达，而survivin的存在能选择性抑制caspase3活性[23]，AFP就是通过这两个层次来抑制caspase3活性。本研究结果说明，AFP对凋亡信号的调控，主要作用靶点是抑制caspase3活性，而对上游的caspase8活性则没有明显的影响。所以本研究结果提示肝癌细胞高表达AFP是耐受TRAIL的重要原因，也是耐受依赖caspase3途径诱导肿瘤细胞凋亡的其他生物因子或化学药物的重要因素。肝癌细胞干细胞亚群(side population， SP)是肝癌细胞延续生长和耐受药物作用的细胞基础，肝癌SP细胞伴有AFP高表达现象[35]，肝癌细胞[3638]、胃肠癌细胞[3941]的转移和侵袭也伴随AFP的高表达，血液AFP的存在能诱导淋巴细胞凋亡，使肝癌细胞逃避淋巴细胞的监控[4244]，所以AFP被认为是一种与肿瘤恶性生长密切相关的重要细胞因子，抑制AFP表达将增加肝癌细胞对淋巴细胞因子例如TRAIL等药物的敏感性，减少其伤害T淋巴细胞。因而，靶向抑制AFP表达将是一种有效的生物治疗肝癌的新策略。

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