帕金森病模型大鼠背外侧被盖核神经元电活动的变化

　　　　作者：崔海燕，刘健，王涛，李旭光，戎浩

【摘要】 目的 观察转化生长因子βⅡ型受体(TGFβRⅡ)及纤维连接蛋白(Fn)在小鼠肾泌尿小管发育中的时空性表达，探讨TGFβRⅡ和Fn与泌尿小管发育的关系。方法 采用免疫组织化学技术结合体视学方法，测定不同胚龄(E12、14、16、18d)及生后日龄(P1、3、7、14、21、28、42d)小鼠肾泌尿小管TGFβRⅡ和Fn的表达及其含量变化。结果 TGFβRⅡ在各期肾小管及集合管内均有表达，其表达量随着发育逐渐增加，但在各期近端小管强烈表达，各期集合管表达较强，而各期远端小管表达较弱;Fn在各期肾小管、集合管的基底膜处均有表达，其表达量随着发育逐渐增加。结论 TGFβ和Fn可能对小鼠肾泌尿小管的发育以及成熟泌尿小管结构的维持起重要作用。

【关键词】 转化生长因子βⅡ型受体;纤维连接蛋白;泌尿小管;发育;小鼠

　ABSTRACT: Objective To observe the chronological and spatial expressions of transforming growth factorβ receptor Ⅱ (TGFβRⅡ) and fibronectin (Fn) in uriniferous tubules of mouse kidney and investigate the correlation of TGFβRⅡ and Fn with development of uriniferous tubules. Methods The expressions and content changes of TGFβRⅡ and Fn were examined by immunohistochemistry and stereological method in mouse kidneys on embryonic days 12， 14， 16 and 18 and postnatal days 1， 3， 7， 14， 21， 28 and 42. Results The expression of TGFβRⅡ was found in all stages of renal tubules and collecting ducts and increased gradually with the kidney development; however， the expressions were obvious in all stages of proximal tubules and collecting ducts， while little was observed in all stages of distal tubules. The expression of Fn was detected in all stages of renal tubules and collecting ducts and also increased gradually with the kidney development. Conclusion TGFβRⅡ and Fn might play an important role in the development and maturation of uriniferous tubules of mouse kidney.

　　KEY WORDS: transforming growth factorβ receptor Ⅱ; fibronectin; uriniferous tubule; development; mouse

　转化生长因子β(transforming growth factorβ， TGFβ)超家族成员是在机体发育和组织内环境稳定中起着重要作用的多功能生长因子[1]，具有调节细胞生长、死亡或凋亡、细胞分化和细胞外基质合成等生物学功能。TGFβ受体有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3型，仅Ⅱ型受体(TGFβRⅡ)能直接与游离配体结合，是主要的信号转导受体[2]。纤维连接蛋白(Fibronectin， Fn)是细胞外基质重要的组成部分，其最重要的功能特性是参与细胞与细胞、细胞与基质之间的粘连[3]。TGFβRⅡ和Fn表达于肾发育过程的多种结构中，但具体部位仍有争议[13]，其在小鼠肾发育中的研究国内外尚未见系统报道。本研究采用免疫组织化学技术结合体视学方法，检测TGFβRⅡ和Fn在小鼠肾泌尿小管发育中的表达及其含量的变化，探讨两者与肾泌尿小管发育的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 组织取材及标本制备 取成年健康昆明小白鼠，按雌雄比例1∶1同笼饲养，每日早晚8时各观察一次雌鼠怀孕情况，以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄0d(E0)[45]。孕鼠分笼饲养2周始每日早晚8时各观察一次仔鼠出生情况，以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后0d(P0)。孕鼠分为11组，每组4只，每只孕鼠最多取2只胎鼠或仔鼠，分别取E12、14、16、18胎鼠和P 1、3、7、14、21、28、42d仔鼠肾脏，每组共计8只。孕鼠经100mL/L水合氯醛麻醉后剖腹取出胎鼠，E12胎鼠全胚固定，E14、16、18胎鼠取其左肾固定。仔鼠经100mL/L水合氯醛麻醉后，切开腹后壁取出左肾，用排刀法沿横轴将肾脏切开，入100mL/L中性甲醛溶液固定，系列乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡定向包埋，作5μm厚连续切片[6]。

　　1.2 免疫组织化学染色 将切片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，分别用兔抗小鼠TGFβRⅡ和羊抗小鼠Fn多克隆抗体(1∶100， Santa Cruz)及SABC法进行免疫组织化学染色，DABh3O2显色。阳性表达呈不同程度的棕黄色，TGFβRⅡ免疫反应产物位于细胞质内，Fn免疫反应产物位于基底膜处。

　　1.3 体视学测量 根据肾组织切片的多少等间隔选取5张切片，每张切片按“S”形系统随机选取5个视野，在10×100倍光镜下分别对TGFβRⅡ和Fn在各期肾小管及集合管表达的阳性部位采用体视学方法进行体密度和面密度测定。应用方格测试系统，点计数法，根据公式VV=ΣPx/ΣPc测算出TGFβRⅡ阳性表达的体密度，其中VV为体密度值，表示TGFβRⅡ在各期肾小管及集合管的相对含量，ΣPx为方格系统落在各期肾小管及集合管TGFβRⅡ阳性细胞内的点数，ΣPc为方格系统落在参照系(相应的各期肾小管及集合管)的点数。应用方格测试系统，交点计数法，根据公式Sv=2Ix/Lc(Lc=ΣPc·a)测算出Fn阳性表达Sv值，其中Sv为面密度值，表示Fn在肾小管及集合管基底膜处的相对含量，Ix为肾小管及集合管Fn阳性表达的基底膜与测试方格的交点数，ΣPc为方格系统落在参照系(相应的各期肾小管及集合管)的点数，a为方格的两点间距离，在10×100倍光镜下相当于实际长度0.01mm[5]。

　　1.4 统计学处理 所有实验数据以±s表示，采用SPSS软件进行单因素方差分析，并用SNKq检验进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 免疫组织化学染色结果 TGFβRⅡ的表达(图1)。E12在输尿管芽表达，E14在分化早期的近端和远端小管表达，E16至E18，在发育期的近端和远端小管以及集合管表达。P1至P3，在发育各期的近端、远端小管以及集合管表达;从P7至P42，在成熟期的近端和远端小管以及集合管表达。表达的强度依次为：近端小管强烈表达，集合管表达较强，远端小管表达较弱。阴性对照肾组织内无TGFβRⅡ的阳性表达。

　　Fn的表达(图2)。E12在输尿管芽的基底膜处表达，E14在分化早期的近端及远端小管的基底膜处表达;E16至E18，在发育期的近端和远端小管以及集合管的基底膜处表达。P1至P3，在发育各期的近端、远端小管及集合管的基底膜处表达;从P7至P42表达于成熟期的近端、远端小管及集合管的基底膜处。阴性对照肾组织内无Fn的阳性表达

　　A：E14分化早期近端小管与远端小管;B：E18发育期近端小管与远端小管;C：P42成熟期近端小管与远端小管;D：E18发育期集合管;E：P42成熟期集合管。近端小管(▲)，远端小管(△)，集合管(↑)。

　　2.2 体视学测量结果 随着肾组织各结构的发育成熟，TGFβRⅡ在各期肾小管及集合管阳性表达的体密度值和Fn在各期肾小管及集合管基底膜处表达的面密度值均逐渐增加，表明其表达量逐渐增加(表1、表2)。表1 小鼠发育各期肾小管及集合管内TGFβRⅡ阳性细胞的体密度值表2 小鼠发育各期肾小管及集合管基底膜处Fn阳性表达的面密度值

　　3 讨 论

　　朱平等[7]研究表明，肾小管的发育成熟程度与所属肾小体的发育程度相一致。他们将肾小管发育过程分为3期：分化早期、发育期、成熟期。集合管发育也大致可以分为此3期，但是其分化早期可认为是输尿管芽阶段。

　　本实验观察到在各期的肾小管及集合管内，TGFβRⅡ的表达量依次为近端小管大于集合管，集合管大于远端小管;并且随着肾的发育，TGFβRⅡ在各期肾小管及集合管的体密度值均逐渐增加，表明它们的表达量随着肾的发育成熟逐渐增加。CHOI等[2]也曾提出，TGFβRⅡ在大鼠肾发育中的近端小管上皮细胞内强烈表达;而有学者[8]则提出TGFβRⅡmRNA表达于大鼠肾的皮质集合管、远端小管，近端小管未见表达。结合本实验的结果，我们认为各期的肾小管及集合管内TGFβRⅡ均有表达，但其表达量明显不同。表明TGFβ在近端小管的发育过程中所起的促进作用更为重要，而在远端小管及集合管内所起的促进作用相对较弱。

　　本实验还观察到Fn在各期肾小管及集合管的基底膜处均有表达;并且随着肾的发育，Fn在各期肾小管及集合管表达的面密度值均逐渐增加，表明它们的表达量逐渐增加。有学者也曾提出Fn在小管基底膜弥漫表达[3，9]，并且在体外培养的正常小管上皮细胞也可分泌Fn[1011]。推测Fn 参与肾小管及集合管发育成熟的过程，并在维持肾小管及集合管形态方面发挥作用。

　　综上所述，TGFβ(通过TGFβRⅡ的介导)和Fn对肾泌尿小管各结构的发育以及成熟肾泌尿小管各结构的维持都起到了重要作用，但是TGFβ和Fn对肾发育的作用机制以及对肾各结构发育促进作用的程度有待进一步阐述。近年来研究表明，由于某种原因，在肾发育过程中TGFβ、TGFβRⅡ和Fn的改变均可引起多种先天性肾疾病，如Alport综合征[8]、薄基底膜肾病[12]及多囊肾、肾缺如[9]。因此，在分子生物学水平上进一步研究TGFβ和Fn对肾发育的作用机制，可为临床先天性肾疾病的研究提供实验资料。

参考文献

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