作者：卜丽梅 刘芬 曲洪源 巩继涵 石卓 华树成
【摘要】 目的探讨甘草酸二铵(DGPS)对实验大鼠COPD的治疗作用其作用机制。方法采用给实验大鼠被动吸烟和气管内注入脂多糖相结合的方法，诱导建立大鼠COPD模型。将实验动物按体重随机分为3组：空白对照组、模型组、DGPS治疗组。放射免疫法测定各组大鼠血清中透明质酸(Hyaluronan，HA)和层黏连蛋白(Laminnin， LN);液相竞争法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;免疫组化染色法检测NF-κB阳性细胞数，Western印迹测定NF-κBp50蛋白的表达;观察肺组织结构的大体变化及光镜下改变。 结果DGPS明显降低血清HA、LN、TNF-α的水平，与模型组相比有统计学意义(P<0.05);DGPS组肺组织NF-κBp50的阳性细胞数减少和NF-κBp50蛋白表达下调。结论DGPS可抑制细胞因子的产生，从而保护残存肺细胞发挥抗COPD作用;并通过下调NF-κBp50蛋白的表达，减少炎症介质的释放，发挥抗炎作用，减轻肺损伤程度。
【关键词】 慢性阻塞性肺疾病;甘草酸二铵;透明质酸;肿瘤坏死因子-α;NF-κB
目前研究认为慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发病机制与肺部的蛋白酶和抗蛋白酶失衡，氧化和抗氧化失衡，实质和肺血管的慢性炎症有关〔1〕。由于以上原因导致了气道的慢性损伤以及不完全修复过程，以致气道结构和功能改变，即气道重塑，这是COPD不可逆气流受限的主要原因〔2〕。进一步可发展成慢性肺源性心脏病或慢性呼吸衰竭。甘草酸二铵(DGPS)，具有抗炎、抗过敏、抗变态反应、抗生物氧化及免疫调节等多方面功能〔3〕。具有较高的亲脂性，易与体内受体蛋白及类固醇激素靶细胞结合，产生糖皮质激素样的药理作用〔4〕。DGPS在COPD中的抗炎、抗过敏、抗变态反应作用，可抑制气道黏液分泌，降低气道阻力，达到治疗COPD的目的。本文主要采用给实验大鼠被动吸烟和气管内注入脂多糖相结合的方法建立大鼠COPD模型，然后通过血清放免法、免疫组化、Western印迹、光镜等多种方法，从整体水平研究DGPS对COPD的作用及其机制。
1材料与方法
1.1实验动物、药品、试剂与仪器健康雄性Wistar大鼠30只，体重(200±20) g。购自吉林大学基础医学院实验动物中心，合格证号：SCXK(吉)2005-0001。生命源牌过滤嘴香烟，长春烟草有限责任公司出品;脂多糖，Sigma公司;DGPS注射液，连云港正大天晴制药有限公司，批号:20040502;分析天平日本; IX51型倒置显微镜，日本OLYMPUS;微量移液器，上海求精公司;GAMAⅡγ计数器，瑞士KONTRON;有机玻璃烟熏箱，吉林大学基础医学院药理实验室自制;OPTI血气分析仪，AVL Scientific公司;LDZ5-2型离心机，北京医用离心机厂。肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒，解放军总医院科技开发中心放免所，批号:010349;层黏连蛋白(LN)放免试剂盒，上海海研医学生物技术有限公司，批号:261427;透明质酸(HA)放免试剂盒，上海海研医学生物技术有限公司，批号:220021。
1.2实验分组及模型制备将30只大鼠实验室饲养2天稳定后，将大鼠随机分为(1)空白对照组：正常饲养，第16日开始每日腹腔注射生理盐水(0.5 ml/100 g)，1次/d，持续30 d;(2)模型组：第1、16天气管内注入LPS各一次。具体方法：将10%水合氯醛溶液(0.035 mg/kg)经腹腔注射，麻醉模型组大鼠，麻药生效后，将大鼠仰卧位固定在操作台上，暴露喉头，以静脉穿刺针代替气管插管行气管插管，插管后按体重以LPS(20 mg/kg)为标准，在第1，16天各向大鼠气管内注入LPS 1次，然后将大鼠直立旋转并轻拍其背部，使溶液均匀分布在肺部。之后15 d内，将大鼠放入自制70 cm×60 cm×50 cm有机玻璃箱内被动吸烟，4支/次，30 min/次，1次/d。在造模第16日开始每日腹腔注射生理盐水(0.05 mg/kg)，1次/d，持续30 d;(3)DGPS组：前15 d同模型组。并在造模第16日开始每日腹腔注射DGPS溶液(12.5 mg/kg)，1次/d，持续30 d。
1.3DGPS对COPD大鼠血清中HA、LN、TNF-α含量的影响实验结束后，将大鼠麻醉固定，腹主动脉采血，3 000 r/min离心取血清，采取放射免疫分析法，按照试剂盒说明书操作测HA、LN及TNF-α。
1.4免疫组化染色法检测肺组织NF-κBp50的阳性细胞数和Western印迹测定NF-κBp50蛋白表达。
1.5肺组织形态学观察给药结束后第2天(总第45天)，称重，腹腔注射10%水合氯醛(0.03ml/kg)。大鼠麻醉后，迅速开胸取出心肺，分离肺脏，取右上肺组织(保留肺门及连接肺门的支气管)置于10%甲醛溶液中固定。固定1 w后，进行切片常规二甲苯透明、浸蜡、包埋，连续5 μm厚切片;再将切片进行常规二甲苯脱蜡，再乙醇脱水，HE染色、中性树胶封片，光镜下观察肺组织形态学变化。
1.6统计学分析以SPSS11.5软件处理，结果用x±s表示，两组间比较采用两样本均数的t检验。
2结果
2.1DGPS对COPD实验大鼠放射免疫血清HA和LN含量的影响见表1。结果显示，模型组血清中HA和LN的含量明显高于空白对照组(P<0.05)，说明模型成立。DGPS组血清HA、LN含量明显低于模型组，具有统计学意义(P<0.05)，且DGPS组低于阳性对照组，说明DGPS可缓解实验大鼠的COPD纤维化作用，且效果优于氨茶碱。表1放射免疫方法检测试验大鼠血清HA和LN的含量
2.2液相竞争法检测DGPS对COPD实验大鼠TNF-α含量影响模型组血清中TNF-α含量〔(2.43±0.46) ng/ml〕明显高于空白对照组〔(1.56±0.24) ng/ml〕(P<0.05)，DGPS组TNF-α含量〔(1.89±0.32) ng/ml〕与模型组相比有一定下降趋势，但无统计学意义(P>0.05)。
2.3免疫组化染色法检测NF-κBp50的阳性细胞数和蛋白的表达空白组肺组织中有少量NF-κBp50表达(8.94±4.27);模型组NF-κBp50明显高表达(30.27±12.30)(P<0.001);DGPS组NF-κBp50表达(14.59±8.32)明显少于模型组(P<0.05)。
2.4Western印迹检测NF-κBp50蛋白表达模型组NF-κBp50蛋白表达(292.53±34.27)显著上调，灰度强。空白对照组NF-κBp50表达灰度低(129.24±17.63)，DGPS组灰度(167.25±21.12)介于二者之间。见图1。
2.5肺组织形态学观察大体观察：与空白对照组对比，模型组大鼠肺脏体积明显增大，颜色发白或变黑，部分肺表面有散发局灶性坏死;肺弹性减弱，失去回缩力，开胸后肺不回缩。DGPS组大鼠肺脏体积无明显增大，肺表面无坏死。肺弹性良好。光镜观察：HE染色切片显示。见图2。图1DGPS对COPD大鼠NF-κBp50蛋白表达的影响图2各组大鼠肺组织病理改变(HE，×100)空白对照组：大鼠支气管及肺泡结构均正常，支气管黏膜上皮细胞排列整齐，未见杯细胞，支气管腔无分泌物，肺泡结构正常，肺泡壁完整。模型组：大鼠气管、支气管黏膜上皮细胞排列不规则、倒伏，有不同程度的脱落，杯状细胞明显增多，各级气管管壁周围有大量炎症细胞浸润，淋巴细胞、巨噬细胞为主，并可见少量中性粒细胞，支气管管壁增厚，平滑肌肌束增粗，且排列不规则。肺泡腔明显增大，肺泡内可见炎性细胞，局灶性肺泡破坏，部分肺泡融合成肺大泡，形成肺气肿。DGPS组：气管管腔狭窄、管壁平滑肌增生、肌束增粗、气道上皮细胞脱落、炎症细胞浸润、杯状细胞增生等形态改变，与模型组相比均有不同程度减轻。
3讨论
本实验结果证实，DGPS具有抗COPD作用。表现为明显降低HA、LN、TNF-α、PaCO2水平，下调NF-κBp50蛋白的表达;明显减轻COPD的损伤程度，组织学检查同样显示显著的抗COPD作用。其机制为DGPS具有抗炎、抗过敏、抗变态反应、抗生物氧化及免疫调节等多方面功能。DGPS有较高的的亲脂性，易与体内受体蛋白及类固醇激素靶细胞结合，产生糖皮质激素样的药理作用〔5〕。其抗炎作用确切、缓和;对于严重肺部病变DGPS可以抑制强烈的炎症反应，保护残存肺细胞，促进肺细胞再生〔6~10〕;类糖皮质激素样作用具有抗变态反应作用，因此，在药物性肺损害的应用也有明显的疗效;药物撤退后“反跳”作用相对较弱。在综合治疗基础上加用大剂量DGPS治疗慢性重症肺部病变，能显著促进肺功能恢复、减轻肺脏的损伤程度、降低死亡率;DGPS并不影响糖皮质轴的活性，因而不会出现外源性糖皮质激素样的全身性副作用;并且 DPGS在体内绝大多数与血浆蛋白结合，游离甘草酸发挥药效，结合甘草酸与游离甘草酸在体内达到动态平衡，因而不会导致体内类固醇蓄积〔11，12〕。而且治疗的耐受性良好，无不良反应，安全有效，值得推广。DGPS在COPD中的抗炎、抗过敏、抗变态反应作用，抑制气道黏液分泌，降低气道阻力，达到治疗COPD的目的。
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