作者：王海英 陈宝琴 解英俊
【摘要】 目的观察罗格列酮对糖尿病大鼠心肌组织水通道蛋白1 (AQP1)表达的影响，探讨罗格列酮对糖尿病大鼠早期心肌病变的干预作用。方法将刚建立2型糖尿病模型的大鼠随机分为罗格列酮大、小剂量干预组各8例和模型组9例，以及正常大鼠10例，8 w后应用免疫组织化学和Western 印迹方法测定心肌组织AQP1的表达变化。结果罗格列酮可降低血清心肌酶的释放，稳定心肌组织中AQP1蛋白的表达，且以大剂量组疗效显著，对早期糖尿病大鼠心肌具有一定保护作用。结论罗格列酮可通过稳定早期糖尿病心肌组织中AQP1 蛋白的表达，在一定程度上缓解糖尿病心肌病变的发生与发展。
【关键词】 水通道蛋白1;糖尿病心肌病
有研究认为在2型糖尿病早期过度的营养物质摄入，尤其是长期的摄入造成肥胖会增加炎性反应，而炎性因子具有全身性和心脏局部效应，与糖尿病一起协同诱导糖尿病心脏病发生。在很多炎症的病理研究中都显示了AQPs的表达变化〔1〕，我们通过前期实验已证实AQP1在糖尿病心肌病大鼠心肌组织中较正常大鼠表达减少。过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(PPARγ)作为重要的核转录因子，在转录水平调节多种基因表达，起到调节脂肪酸及葡萄糖代谢、抑制炎症反应等重要的生物学作用〔2〕。本研究进一步观察PPARγ受体激动剂罗格列酮对糖尿病大鼠心肌组织中AQP1表达及调控的影响，从而探讨罗格列酮对早期糖尿病大鼠心肌病变的保护作用。
1材料与方法
1.1动物与试剂雌性4周龄wistar大鼠60只，体重(200±10)g，购自吉林大学实验动物中心。链脲佐菌素，美国Sigma 公司;心肌酶试剂盒，北京中山生物科技股份有限公司;AQP1兔抗大鼠多克隆抗体、β-actin单克隆抗体，美国Santa Cruz公司;即用型SABC试剂盒，北京中山生物科技股份有限公司。
1.2方法
1.2.1糖尿病大鼠模型复制及分组45只大鼠随机分为糖尿病大鼠 (DMR，35只 )和正常大鼠 (CTR，10只 )。参照文献方法〔3〕，DMR给予高糖高脂饲料(10%猪油、20% 蔗糖、70%常规饲料)喂养，4周末给予链脲佐菌素25 mg/kg(用枸橼酸钠缓冲液溶解，pH4.5) 腹腔注射，CTR仅给予枸橼酸钠缓冲液(pH4.5)腹腔注射，两组大鼠每周重复1次上述处理过程，连续4 w，末次血糖≥16.7 mmol/L者为糖尿病模型动物。存活的糖尿病大鼠共25只，随机分为3组：(1)模型组(DMR)9只，等体积蒸馏水灌胃给药。(2)罗格列酮小剂量干预组(RL)8只，按3 mg·kg-1·d-1灌胃治疗。(3)罗格列酮大剂量干预组(RH)8只，按6 mg·kg-1·d-1灌胃治疗。以上处理方法每周根据体重变化随时调整。用药8 w后，断颈处死大鼠，迅速抽净心腔内血液，取出心脏组织，用冷等渗盐水洗净，滤纸吸干，将组织标本编号后立即置入-70℃液氮中保存备用。
1.2.2观察项目及方法血糖使用强生血糖仪经尾静脉采血测定。心肌酶〔天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸磷酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)〕由全自动生化分析仪测定，按试剂盒说明书进行操作。心脏组织标本以4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片。石蜡切片进行免疫组化染色(10%甲醛固定，石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察)，阴性对照组用未被免 疫的兔血清1∶200稀释，替代Ⅰ抗，余步骤同上。心肌组织微血管呈现棕黄色为阳性，所有切片放大倍数为400倍。心肌组织匀浆用Western印迹检测AQP-1蛋白表达，以β-actin为内对照，所有特异性条带的光密度值采用凝胶成像分析系统进行吸光度扫描及数据分析，以AQP1与β-actin灰度值的比值为AQP1蛋白的相对表达量。
1.3统计学处理使用SPSS10.0软件，计量资料以x±s表示，采用t检验进行组间比较。
2结果
2.1心肌酶的变化第16周末检测血清心肌酶(CK、LDH、AST)的水平。DMR组血清CK、LDH、AST的水平均显著高于CTR组(P<0.01)，RL、RH组CK、LDH的水平较DMR组显著降低(P<0.01)。表1两组大鼠血清CK、LDH、AST的变化
2.2心肌微血管内皮AQP1表达的变化2.2.1AQP1的表达AQP1在CTR的心肌组织主要分布于血管内皮细胞、心肌细胞的胞膜上，以血管内皮细胞最为明显;在DMR、RL、RH组 AQP1的特异性染色定位未改变。见图1。图1各组大鼠心肌微血管内皮AQP1的表达(×400)
2.2.2AQP1蛋白印迹分析AQP1 蛋白在糖尿病心肌病大鼠心脏组织表达与正常心脏组织以相同的糖化形式。DMR组AQP1蛋白量(1.25±0.21)较CRT组(2.08±0.26)有所减少(P<0.05);RL、RH组AQP1蛋白量〔(1.86±0.23)，(2.82±0.57)〕较模型组有所增加(P<0.05，P<0.01)。见图2。图2Western印迹检测AQP1蛋白在心肌组织中的表达
3讨论
目前，全球约有3亿多糖尿病患者，而我国糖尿病的发病率已达9.7%，患病人数达9千多万。糖尿病的根本危害在于各种慢性并发症，多数患者死于心血管并发症，因此，糖尿病的防治还要早期开始预防和延缓并发症的发生和发展，从而降低病死率。我们采用高脂高糖饮食加小剂量STZ模拟人类2型糖尿病的发病过程，应用临床上最常用的噻唑烷二酮类药物——罗格列酮干预治疗8 w，观察其对糖尿病大鼠心肌病变的保护作用，结果发现：与模型组相比，罗格列酮干预组血清心肌酶有所降低，有统计学意义，RSG大剂量治疗组上述指标改善作用更显著。PPARγ受体是一种蛋白质，存在于胰岛素敏感组织如脂肪、骨骼肌和肝脏中，罗格列酮是高度选择性且作用很强的PPARγ激动剂。对罗格列酮的药理学研究证明胰岛素增敏作用是通过与PPARγ结合并使之活化，进而增加多种蛋白质的合成，这些蛋白质非常重要，并且在细胞对胰岛素产生生物反应时参与葡萄糖转运、利用以及脂代谢过程〔4〕。本研究证实RSG有抑制心肌酶释放的作用，提示RSG对糖尿病大鼠心肌病变有保护作用。Golfman研究发现〔5〕，PPARγ配体作用于糖尿病大鼠模型，可以增加GLUT4和GLUT1的转录，从而增加心肌细胞有氧代谢的能力。在对小鼠、大鼠和人类心肌组织的水通道蛋白进行研究中〔6〕，RT- PCR检测结果显示：在小鼠心脏有AQP-1，4，6，7，8，11 mRNA的表达;在大鼠心脏有AQP-1，6，7，11 以及低水平AQP-4，9 mRNA的表达;在人类心脏有AQP-1，3，4，5，7，9，10，11 mRNA的表达。而我们的前期实验证实了正常大鼠心肌组织中AQP1的主要分布在心肌微血管内皮细胞的胞膜上，糖尿病心肌病造成AQP1蛋白表达下调。随着对水通道蛋白调节水转运的深入研究，已不仅限于对水代谢紊乱疾病诊断与治疗，大量研究证实许多疾病可能与 AQPs 功能异常或调节失控有关。目前国外已有研究证实AQP1在微血管形成时优先表达，通过增加通透性来利于血管生成。Saadoun等〔7〕通过AQP1敲除小鼠血管内皮细胞体外培养实验证实AQP1在内皮细胞迁移中的重要作用，并成为AQP1缺失引起血管生成障碍的重要机制。进一步研究发现AQP1可作为一个重要的胞膜复合体，参与细胞骨架的构建、黏附和运动等生理作用〔8〕。本实验进一步通过免疫组化和Western blotting方法观察罗格列酮对糖尿病大鼠心肌组织中AQP1蛋白的表达和调控影响。本实验中糖尿病大鼠给予罗格列酮治疗8周后，心肌组织AQP1免疫组织化学和Western blotting结果提示罗格列酮可稳定心肌微血管内皮细胞的胞膜上AQP1蛋白的表达，有统计学意义，进一步证实了罗格列酮对早期糖尿病心肌病变的干预作用，罗格列酮调控AQP1蛋白表达的分子机制还有待于进一步研究。
参考文献
1McCoy E，Sontheimer H.MAPK induces AQP1 expression in astrocytes following injury〔J〕.Glia，2010;58(2):209-17.
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3王祥，李长运，曾秋棠，等.大鼠2型糖尿病心肌病模型的建立方法〔J〕.中国病理生理杂志，2006;22(9):1868-70.
4张文礼.罗格列酮的非降糖作用〔J〕.重庆医学，2008;37(6)：660-2.
5Golfman LS，Wilson CR，Sharma S，et al.Activation of PPAR-gamma enhances myocardial glucose oxidation and improves contractile function in isolated workinghearts of ZDF rats〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab，2005;289(2):E328-E336.
6Butler TL，Carol G Au，Yang B，et al.Cardaic aquaporin expression in human，rat and mouse〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006;291(2):H705-13.
7Saadoun S，Papadopoulos MC，Hara Chikuma M，et al.Impairment of angiogenesisand cell migration by targeted aquaporin-1 gene disruption〔J〕. Nature，2005;(7034)：786-92.
8Monzani E，Bazzotti R，Pereqo C，et al.AQP1 is not only a water channel：itcontributes to cell migration through Lin7/beta-catenin〔J〕.PLoS One，2009;4(7):6167.