【摘要】 目的探讨血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂氯沙坦对D-半乳糖致衰老大鼠肾脏的保护作用及可能机制。方法将36只大鼠随机分为3组：正常对照组、衰老模型组及氯沙坦治疗组，每组12只。D-半乳糖连续腹腔注射制备亚急性衰老大鼠模型。组织学检查肾组织病理改变，免疫组化方法检测肾组织中结缔组织生长因子(CTGF)、纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)的水平。结果组织学检查发现模型组肾小球体积增大，分布稀疏，不同程度的局灶节段性肾小球硬化，肾小管管腔扩大，灶状小管萎缩，间质纤维化;治疗组肾组织改变与模型组相比有所减轻。免疫组化半定量分析结果显示治疗组CTGF、PAI-1的水平较模型组明显减低(P<0.05)。结论氯沙坦可以抑制CTGF、PAI-1的表达，抑制细胞外基质的积聚，减轻肾间质纤维化，从而减轻衰老，发挥肾保护作用。
【关键词】 氯沙坦;衰老;结缔组织生长因子;纤溶酶原激活物抑制物-1
肾脏是人体最重要的器官，其衰老对机体的影响尤为重要。目前导致肾脏衰老的机制还不完全清楚〔1〕，在众多调控因素中肾素-血管紧张素系统(RAS)起着重要作用。衰老肾脏的病理改变及尿蛋白的增加都可能与肾脏局部血管紧张素升高相关。氯沙坦为血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)Ⅰ型受体拮抗剂，可阻断AngⅡ与其Ⅰ型受体结合，从受体水平拮抗其生物学效应，从而降低肾小球毛细血管内压，改善肾血流动力学异常，缓解早期的高滤过、高灌注状态，减少尿蛋白，保护肾功能。本实验观察了氯沙坦对D-半乳糖致大鼠衰老模型的影响，观察大鼠肾脏的形态变化，并测定大鼠肾组织CTGF和PAI-1的表达，以探讨氯沙坦延缓肾脏衰老的作用机制。
1材料与方法
1.1实验对象成年SD大鼠36只，体重250~300 g(由辽宁医学院实验动物中心提供)。
1.2衰老模型建立大鼠每日腹腔注射D-半乳糖(100 mg/kg体重)，连续42 d，形成糖代谢紊乱所致的亚急性衰老模型。
1.3实验分组36只大鼠随机分为正常对照组、衰老模型组及氯沙坦治疗组，每组12只。氯沙坦治疗组每天予氯沙坦40 mg/ kg灌胃。其他两组每天予等量生理盐水灌胃。
1.4实验试剂兔抗CTGF多克隆抗体、小鼠抗大鼠PAI-1抗体(武汉博士德有限公司);SP工作液试剂盒(北京中山公司);氯沙坦钾(商品名：科素亚，杭州默沙东制药有限公司)。
1.5组织学检查肾组织常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋。4 μm石蜡切片用于HE、Masson染色，光镜下观察。
1.6免疫组化检测(ABC法)4 μm的石蜡切片脱蜡入水，加3%的过氧化氢，CTGF、PAI-1以微波修复抗原，以蛋白阻断液阻断20 min，滴加一抗，4℃过夜，然后加入二抗，室温20 min，再加链霉素-生物素-辣根过氧化物酶复合物工作液，室温20 min，用DAB显色，显微镜下控制显色时间，最后以苏木素复染、脱水、透明、封片，PBS替代一抗作阴性对照。用计算机图像分析软件进行计算机读片，以对阳性染色区域的积分光密度值做半定量分析。
1.7统计学方法实验数据以x±s表示，用SPSS11.0统计软件分析，各组间进行组间单因素方差分析。
2结果
2.1大鼠肾组织标本病理改变正常对照组大鼠肾小球分布密集，呈圆形或椭圆形，外周规整，肾小囊的囊腔正常，肾小管的管腔规整;衰老模型组大鼠肾小球体积增大，肾小球分布稀疏，不规整，不同程度的局灶节段性肾小球硬化，肾小囊的囊腔明显扩大，肾小管管腔扩大，上皮细胞变性而且大小不均，灶状小管萎缩，间质纤维化，及少量单核细胞浸润;氯沙坦治疗组大鼠肾小球数量与衰老模型组相比明显增多、肾间质纤维化程度明显减轻，肾小管灶状上皮细胞空泡变性，无萎缩 和代偿性肥大，未见间质水肿，见图1。
2.2免疫组化指标测定见图2，图3。CTGF在正常对照组肾间质区无或仅有微量表达，在模型组肾间质可见较多的散在的片状分布，以髓质区最为明显，而治疗组较模型组明显减轻(P<0.05)。PAI-1仅在正常对照组大鼠小管上皮细胞胞浆有图1各组大鼠肾脏结构比较(HE，×100)图2各组肾间质CTGF的表达(DAB，×200)图3各组肾间质PAI-1的表达(DAB，×200)少量表达。模型组大鼠主要表达在肾小球壁层上皮细胞、内皮细胞及系膜细胞，小血管的内皮细胞及平滑肌细胞和肾小管上皮细胞。而治疗组大鼠肾小球及小管上皮细胞表达比模型组有所减轻。免疫组化半定量分析结果可见，衰老模型组肾组织CTGF和PAI-1的积分光密度明显高于对照组，而氯沙坦治疗组则明显降低，表明在衰老模型组肾组织CTGF和PAI-1的表达明显增高，而氯沙坦可以降低衰老大鼠肾组织的CTGF和PAI-1的表达水平，见表1。表1肾间质CTGF、PAI-1的表达水平
3讨论
肾脏衰老是机体衰老的重要组成部分，肾小球硬化，肾小管萎缩及肾间质纤维化是老年人肾脏的主要病理改变。本实验发现，经注射D-半乳糖的衰老模型组大鼠肾小球体积增大，肾小球分布稀疏，不同程度的局灶节段性肾小球硬化，肾小管管腔扩大，上皮细胞低矮变薄或有体积明显增大，而且大小不均，灶状小管萎缩，间质纤维化，及少量单核细胞浸润。导致肾脏衰老的机制还不完全清楚，可能与端粒的缩短，氧化性损伤，遗传因素等有关〔2〕。目前普遍认为细胞外基质(ECM)积聚是肾小球硬化及小管间质纤维化的最主要原因之一。在衰老过程中同样也存在ECM生成与降解的失衡。纤溶酶原激活物(PAs)及其抑制物是参与调节ECM代谢的关键酶系。PAs激活的纤溶酶不仅可直接降解纤维蛋白及其他ECM成分，而且是基质金属蛋白酶(MMPs) 的激活剂〔3〕。PAI-1能特异性抑制组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)激活纤溶酶原，和t-PA 形成复合物使它们失去活性。PAI-1也可抑制凝血因子9a、12a、激肽释放酶活性，还可通过蛋白酶抑制途径抑制尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)的活性，从而减少ECM的降解〔4〕。本实验观察到模型组PAI-1表达明显升高，提示PAI-1为肾小管间质纤维化形成的重要致病因子，参与了衰老的发生。
本实验还观察了CTGF在衰老肾脏的表达。目前认为CTGF很可能是转化生长因子β1(TGF-β1)介导肾间质纤维化的重要下游因子〔5，6〕，研究发现，在一些伴有细胞增殖、基质沉积的小管间质损伤疾病，特别是伴有明显间质纤维化的病变中，肾间质内CTGF mRNA表达明显增高，并与间质损害的程度成正比，说明CTGF增高是纤维化病变中普遍存在的现象〔5〕。本实验发现，模型组肾间质出现了明显的纤维化，同时CTGF的表达水平与正常对照组相比有明显的升高，说明CTGF可能参与衰老肾脏肾间质纤维化的发生。RAS系统具有广泛的生理及病理生理意义。在多种肾脏疾病和动物肾损害模型中，应用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素受体拮抗剂(ARB)除了具有降低血压作用外，还能够减少尿蛋白，减少细胞外基质的聚集，但对于ARB在肾脏衰老中的作用报道尚少。本实验从衰老大鼠肾脏的病理变化观察到，肾小球体积增大、轻度系膜增殖、局灶性肾小管萎缩、炎细胞浸润及蛋白管型，这些病理改变及尿蛋白的增加都可能与肾脏局部血管紧张素增高相关〔7〕。在衰老大鼠应用氯沙坦后可明显下调CTGF、PAI-1的表达，肾间质纤维化程度与模型组相比也有所减轻，表明氯沙坦可以抑制CTGF、PAI-1的表达，抑制ECM的积聚，减轻肾间质纤维化，从而减轻衰老，发挥肾脏保护作用。氯沙坦改善老年大鼠的部分功能及组织学损伤，也从另一侧面提示在衰老肾脏可能存在局部RAS系统的激活〔8〕。总之，本实验表明，氯沙坦通过抑制CTGF、PAI-1的表达，减轻肾间质纤维化的发生，延缓肾脏衰老的进展，为在临床上应用氯沙坦药物治疗肾脏疾病提供了理论依据，但是具体应用到临床还有待于基础研究的进一步深入和大规模的临床实验来证实。
参考文献
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