【摘要】 目的:探讨加味麻杏石甘汤(MG)对卵清蛋白所致实验大鼠支气管哮喘血清及肺组织中NO、ET-1的调节作用。方法:采用腹腔注射卵蛋白和灭活百日咳杆菌，制成大鼠哮喘模型。在此基础上，各组模型鼠分别给予不同的药物“治疗”，2周后处死测定各组大鼠血浆及肺组织NO、ET-1含量。结果:模型组血清及肺组织中NO、ET-1含量均增高，各用药组均有所降低。各组血清NO含量相比差异无统计学意义(P&>0.05)，肺组织NO含量均降低，与模型组相比差异均有统计学意义(P&<0.01)。模型组血浆及肺组织ET-1含量与正常组相比明显增高，差异有统计学意义(P&<0.01);经药物治疗后，各组与模型组比均能明显降低血浆ET-1含量(P&<0.01)。肺组织中NO含量与肺组织ET-1含量有明显相关性(r=0.689，P&<0.01)。结论:通过下调血浆和肺组织NO、ET-1的合成和释放，从而减轻哮喘气道炎症及气道上皮重建，降低气道高反应性，可能是MG治疗哮喘的机制之一。
【关键词】 加味麻杏石甘汤;支气管哮喘;NO;ET-1
支气管哮喘(简称哮喘)是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞等多种炎症细胞参与的非特异性慢性气管炎症。加味麻杏石甘汤是临床上治疗儿童支气管哮喘的有效经验方剂，临床观察小儿哮喘急性发作时服用屡获良效。本研究的主要目标是观察哮喘模型鼠血浆及肺组织中一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)的含量变化，探讨加味麻杏石甘汤(MG)治疗哮喘的作用机理，为MG治疗小儿哮喘的临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物分组及造模 60只雄性SD大鼠，体重180～200 g，日龄28～42 d(华中科技大学实验动物中心提供)，随机分为6组：正常对照组、哮喘模型组、MG小剂量组、MG大剂量组、地塞米松组、MG与地米联合组。参照崔龙苹等[1]介绍的造模方法，除正常对照组外，其余5组于第1天、第5天和第8天分3次腹腔注射抗原液1 mL致敏。第14天开始将大鼠放入自制的不完全封闭的有机玻璃箱内，予1 %卵蛋白(OVA)溶液用超声雾化器喷雾激发，每天1次，每次20 min，共激发12 d。正常对照组用等量的生理盐水进行激发。实验第17天开始给药，每次雾化吸入激发前半小时给予药物干预，中药组给予灌胃MG 每天4.24 g/kg，地塞米松组给予灌胃地塞米松每天0.75 mg/kg，以上各组大鼠给药容量均为10 mL/kg，正常对照组和哮喘模型组灌胃等量生理盐水，均每日1次，共8 d。
1.2 主要仪器 402型雾化吸入器(上海合力医疗器械厂);γ-放射免疫计数器FJ-2021(西安二六二厂)
1.3 实验药物 加味麻杏石甘汤由炙麻黄6 g、生石膏24 g、炒杏仁8 g、炒黄芩12 g、瓜蒌12 g、蝉蜕10 g、地龙12 g、前胡10 g、炙枇杷叶12 g、甘草4 g组成。水煎，过滤，MG小剂量组浓缩至每毫升含生药2.12 g(相当于临床30 kg儿童用量的10倍)，MG大剂量组浓缩至每毫升含生药4.24 g(相当于临床30 kg儿童用量的20倍)，密封于无菌量瓶中，4 ℃储存备用。地塞米松片(0.75 mg×100片)研细末，用蒸馏水配成0.1875 mg/mL的溶液。
1.4 标本采集与测定
1.4.1 血浆采集 各组大鼠断头取血，用一空白试管取血3～4 mL，静置30 min后，在4 ℃条件下低温离心(3 000 r/min)15 min，取血清置于-20 ℃冰箱保存待测NO;另用含10 % EDTA二钠和抑肽酶40 μL(加入适量抑肤酶用以抑制血浆内源性水解酶对待测物的降解)的试管取血2 mL，混匀后，在4 ℃条件下离心(3 000 r/min)10 min，取血浆存于-20 ℃冰箱保存待测ET-1。
1.4.2 肺组织匀浆制备 取少量右肺组织用冰生理盐水冲洗后称重0.1 g左右，按1∶9加4 ℃生理盐水，用玻璃匀浆器在4 ℃条件下制备组织匀浆，3 000r/min离心10 min，提取上清液置于-20 ℃冰箱保存待测。测定前，使样本置于室温中复融，再次于4 ℃下离心(3 000r/min)5min，取上清液测NO、ET-1水平。
1.4.3 血浆与肺组织中NO、ET-1含量测定 NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所，ET-1购自解放军总医院所科技开发中心，放免指标操作按说明书进行。NO测定采用硝酸还原法测定，ET-1测定采用放射免疫分析法。
1.5 数据处理 所有数据用均数±标准差(x±s)表示，用SPSS11.5统计软件进行处理。数据用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，相关性分析采用Pearson方法，以P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组血清及肺组织NO含量变化 模型组血清NO含量增高，各用药组均有所降低，但差异无统计学意义(P&>0.05)。模型组肺组织NO含量与正常组相比明显增高(P&<0.01);经药物治疗后，各组肺组织NO含量均降低，与模型组相比差异均有统计学意义(P&<0.01);MG大剂量组和地塞米松组差异有统计学意义(P&<0.05);MG小剂量组与MG大剂量组、地塞米松组、联合用药组相比差异均有统计学意义(P&<0.01)。详见表1。表1 各组血清及肺组织中NO含量(x±s)
2.2 各组哮喘大鼠血浆及肺组织ET-1含量变化 模型组血浆ET-1含量与正常组相比明显增高 (P&<0.01);经药物治疗后，各组与模型组比均能明显降低血浆ET-1含量(P&<0.01);MG大剂量组与小剂量组比差异统计学意义(P&<0.01);MG大剂量组与联合用药组比差异有统计学意义(P&<0.05)。模型组肺组织ET-1含量与正常组相比明显增高 (P&<0.01);经药物治疗后，各组与模型组比均能明显降低(P&<0.01);MG大剂量组与小剂量组比差异有统计学意义(P&<0.01)。肺组织中NO含量与肺组织ET-1含量有明显相关性(r=0.689，P&<0.01)。详见表2。表2 各组哮喘大鼠血浆及肺组织中ET-1含量变化
3 讨论
哮喘是由多种细胞参与的慢性非特异气管道炎症，以气管高反应性和可逆性气管阻塞为特征的。内源性NO是一种活性很强的自由基，既是细胞信使分子，又是细胞毒性分子，在一定条件下参与组织炎症及损伤[2]，导致气道炎症、气道高反应性和气道上皮损伤。哮喘患者呼出气体中NO含量较正常人高2～3倍，且炎症越明显NO呼出浓度就越高，因此NO浓度的高低可帮助判断气道炎症程度[3]。本实验结果显示：哮喘模型大鼠血清NO含量有所升高，而药物干预各组血清中NO含量较哮喘组亦降低，但无统计学意义。哮喘模型大鼠肺组织NO含量明显升高，而药物干预各组血清中NO含量较哮喘组明显降低，有统计学意义。
ET能直接通过刺激气道平滑肌细胞增生、肥厚，导致气道高反应性;当体内ET升高时，ET可直接作用于平滑肌，也可促进炎症介质和细胞因子的释放，间接作用于气道，且ET-1水平与哮喘严重程度平行，提示ET可能是哮喘发病机制中的重要活性物质之一。本实验结果显示，哮喘模型组血浆和肺组织中ET-1明显高于正常组，肺组织中ET-1水平升高倍数明显高于血浆中ET-1升高的倍数，提示ET-1的增加可能主要源于气道局部合成与释放的增加。药物干预后，各实验组血浆及肺组织ET-1均减低，表明加味麻杏石甘汤能有效降低哮喘大鼠血清及肺组织中ET-1含量水平，减轻哮喘大鼠炎症反应，并能通过降低气道平滑肌收缩而起到降低气道高反应性的作用。
另外，本实验结果亦显示肺组织中ET-1和NO均升高且呈正相关性，提示两者关系密切，一方升高，另一方也升高，两者相互促进，加重气道炎症及支气管痉挛，加重哮喘。
综上分析临床应用中药加味麻杏石甘汤治疗支气管哮喘的机理，可能是通过降低肺组织NO含量，降低血浆及肺组织ET-1的合成和释放，从而减轻哮喘气道炎症及气道上皮重建，达到降低气道高反应性。
参考文献
[1] 崔龙苹，杨永清，陈汉平，等.过敏性哮喘大鼠模型的制备[J].上海实验动物科学，2000，20(2): 69-71.
[2] Ricciardolo FL. Multiple roles of nitric oxide in the airways[J]. Thorax，2003，58(2):175-182.
[3] 陈张琴，王玉霞. NO在支气管哮喘发病、诊断及治疗中的作用[J].实用临床医学，2007，8(8):129-131.