细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及鉴定

　　　　 作者：吕刚，芦亚君，范志刚，史大中，王虎，韩秀

【摘要】 　　目的：构建细粒棘球绦虫（E.g.）成虫全长cDNA质粒文库，并检测文库质量。方法:提取E.g.成虫mRNA，应用SMART方法构建pBluescript II SK全长cDNA质粒文库，检测文库的重组率及容量；用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增，检测插入片段大小。随机挑选阳性重组克隆5′端测序，归并unigene，计算unigene得率，全长性判定主要根据同源全长基因5'末端进行比较判定并计算全长率。结果:成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库。文库的重组率为95.04%，库容量1.13×106；平均插入片段长度约为1.2kb。24个随机阳性克隆测序，unigene比例为69.57%，全长性比率为64.71％。结论:成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库，文库质量良好。

【关键词】 细粒棘球绦虫；成虫；全长cDNA质粒文库；构建；鉴定

　　［ABSTRACT］ Objective: To construct and evaluate fullLength cDNA library of adult Echinococcus granulosus（E.g.）. Methods:mRNA was extracted from the adult E.g. and used for the construction of fulllength cDNA library using SMARTpBluescriptⅡSK kit. The recombination rate and capability of the library was measured and the length of insert fraction of the positive recombinant clones was tested by PCR. Positive recombinant clones were randomly selected for 5'end sequencing and the rates of unigene， fulllength cDNA was analyzed by EST data using bioinformatics. Results: The fulllength cDNA libray of adult E.g. was constructed successfully.The recombination rate and capability of the library were 95.04% and 1.13×106， respectively.The average length of insert fraction was about 1.2kb. 24 recombinant clones randomly selected were sequenced， the rate of unigene and fulllength cDNA were 69.57% and 64.71%. Conclusions: A highquality of fulllength cDNA plasmid library of adult E.g. has been constructed successfully.
　　
　　［KEY WORDS］ Echinococcus granulosus;Adult; Fulllength cDNA plasmid library; Construction; Evaluation

　　细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus，E.g.）成虫寄生于犬科动物小肠，其中绦期幼虫细粒棘球蚴（包虫，echinococcus cyst/hydatid cyst）寄生在中间宿主偶蹄类家畜（羊、牛、马等）及人的多种器官、组织内，引起以占位性病变为主要临床表现的囊型包虫病（cystic echinococcosis，CE），是一种严重危害人类健康和畜牧业生产的人畜共患寄生虫病。CE分布于世界许多国家的牧区，我国是CE的主要流行区之一，主要分布于西北牧区。CE是我国乃至世界一个重要的公共卫生及经济问题［1］，已被列入我国十一五重大寄生虫病防治项目。疫苗及早期诊断是其防治的关键，目前尚无成熟的疫苗及诊断试剂。该虫的基因组学及功能基因组学尚未开展，已知基因甚少，不利于对相关基础问题的研究，更不利于相关疫苗、诊断试剂及药物的研究。
　　
　　本研究目的在于通过构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库并对文库质量进行鉴定，为大规模表达序列标签（expressed sequence tag，EST）测序，开展基因表达谱分析，克隆和鉴定一批功能基因全长cDNA序列，并为开展重要基因的功能研究打下基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂
　　
　　E.g.成虫标本采自青海省西宁市人工感染犬小肠，用灭菌生理盐水漂洗3次后液氮冻存。试剂：Trizol 总RNA提取试剂盒、1 kb DNA 梯度标记物 为GIBCO BRL公司产品；SMART IV 寡核苷酸，CDS III/3JPCR 引物，pBluescript II SK的改造载体（将EcoR I和Not I之间的序列改造为Sfi I A和Sfi I B接头序列），由上海联合基因公司合成和提供；DH5α感受态菌，通用合成引物M13+/M13，异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）和xgal为上海生工生物工程技术有限公司产品；质粒抽提试剂盒，荷兰QIAGEN公司产品；DYEnamicTM ET DYE Terminator Kit（MegaBACETM）为美国Amersham Biosciences产品；MilliQ水纯化系统，美国Millipore公司产品；SpectraMax Plus384连续波长酶标仪，美国Molecular Devices公司产品；FR280电泳仪，上海复日公司产品；HYBAID PCR EXPRESS PCR仪，英国Thermo Hybaid公司产品；ABI PRISM 3700测序仪，美国PE ABI公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 全长cDNA质粒文库的构建

　　1.2.1.1 样品总RNA抽提及mRNA纯化

　　按提取试剂盒操作说明书抽提总RNA产物，于260nm及280nm测吸光度（A260及A280），计算A260/A280比值判定纯度（纯RNA A260/ A280=1.9-2.1），1.1%琼脂糖电泳检测RNA完整性。
　　
　　根据QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits操作说明书进行分离，A260及A280检测及1.1%琼脂糖电泳检测抽提结果。

　　1.2.1.2 cDNA第一链合成

　　0.5mL灭菌离心管中加入以下试剂： 2μg 样品 RNA，1μL SMART IV Oligonucleotide，1 μLCDS III/3' PCR Primer，加水补足5μL，混匀试剂并稍离心，72℃温浴2min，冰浴2min，稍离心后加入下列试剂：2.0μL 5×FirstStrand Buffer，1.0μL DTT (20mmol/L)，1.0μL dNTP Mix (10mmol/L)，1.0μL PowerScript Reverse Transcriptase，总反应体系为10.0μL，混匀试剂并稍离心，42℃温浴1hr，将离心管置于冰上终止第一链合成。

　　1.2.1.3 LD PCR扩增cDNA

　　将PCR仪预热至95℃，反应管中加入下列试剂：2μL cDNA第一链，80μL去离子水，10μL 10×Advantage 2 PCR Buffer，2μL 50×dNTP Mix，2μL 5' PCR Primer，2μL CDS III/3' PCR Primer，2μL 50×Advantage 2 Polymerase Mix，总反应体系100μL。轻拍混匀，稍离心后置于已预热PCR仪，按下面程序开始PCR：95℃ 1min，26cycles;95℃ 15sec，68℃ 6min。 循环结束后取5μL样品1.1%琼脂糖电泳检测。

　　1.2.1.4 PCR产物纯化

　　合并LDPCR产物至0.5mL菌离心管中，加入2μL蛋白酶K（20μg/μL），混匀试剂并稍离心， 45℃温浴20min，离心，加入50μL去离子水， 100μL酚∶氯仿∶异戊醇抽提，17530×g离心5min，收集上层液体转移至另一干净离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇混匀，离心5min，转移上层液体，加入1/10体积3mol/L乙酸钠，2.5倍体积95％室温乙醇，室温条件下立即17530×g离心20min，去上清， 100μL 80％乙醇洗沉淀物，空气干燥约10min，加79μL去离子水溶解沉淀。

　　1.2.1.5 Sfi I消化

　　0.5mL离心管中加入下列试剂：79μL cDNA，10μL 10×Sfi Buffer，10μL Sfi I Enzyme，1μL 100×BSA，加去离子水补充体积至100μL。充分混匀，50℃温浴2h。加2μL 1%二甲苯胺染料。

　　1.2.1.6 cDNA的分级分离

　　备11个收集管，700μL缓冲液清洗spin400柱子后将酶切产物约100μL平稳加于胶层中间，直至产物全部渗到胶面下。加100μL缓冲液使染料层下降数毫米，放置好第一收集管。加600μL缓冲液并开始收集滴出液体，每管收集35μL。合并第2～7管，20℃乙醇沉淀过夜。17530×g离心20min，弃上清，室温干燥10min，加7μL去离子水溶解沉淀，1.1%琼脂糖电泳检测。

　　1.2.1.7 cDNA与pBluescriptⅡSK改良载体相连

　　反应管中加入下列试剂：1.0μL cDNA，1.0μL Vector (25 ng/mL)，1.0μL 10×Ligation Buffer，1.0μL ATP (10mmol/L)，1.0μL T4 DNA Ligase，加去离子水5.5μL至10.0μL，16℃ PCR仪上过夜。

　　1.2.1.8 重组质粒的转化

　　按常规方法取1μL连接液转化200μL感受态大肠埃希菌DH5α。

　　1.2.2 文库质量的鉴定

　　1.2.2.1 质粒文库的容量及重组率

　　转化后的菌液涂布于15cm培养皿(AprIPTG/xgal LB固体培养基)，37℃过夜。计数菌落总数和蓝色菌落数，计算质粒文库的容量和重组率。重组率=（菌落总数蓝色菌落数）/菌落总数×100%；库容量=菌落数×连接产物量。

　　1.2.2.2 插入片段大小

　　随机挑取12个阳性克隆，以通用载体引物M13+/ PCR扩增，扩增产物1.1%琼脂糖凝胶电泳，计算插入片段平均长度。

　　1.2.2.3 5'端EST测序及测序结果的unigene、全长性判定

　　随机挑取24个阳性克隆，送上海联合基因科技有限公司进行测序。＞450bp的序列作为有效序列，使用Washington大学wublast程序(2.0a19MP)对测序结果进行同源性分析。依据100bp 95%的标准进行归并为unigene。通过与相关已知的对应基因的5'末端进行同源比较来判断全长性。

　　2 结果

　　2.1 全长cDNA质粒文库的构建

　　2.1.1 总RNA抽提、纯化及鉴定

　　1.5g成虫样本共抽提获得总RNA 469.4g，OD260、OD280、OD230分别为58.68、27.18、23.51，OD260/OD280=2.16，达到纯度要求，琼脂糖凝胶电泳显示3条清晰条带（图1），表明总RNA完整，符合建库要求。

　　2.1.2 mRNA纯化

　　对所获RNA进行mRNA纯化，终浓度为44.9ng/μL，共获得8.98μg mRNA，OD260、OD280、OD230分别为1.125、0.499、0.535 ，OD260/OD280=2.25，得率为1.9%，符合建库要求。

　　2.1.3 cDNA合成、酶切及分级分离

　　合成第一链cDNA 梯度扩增，反应产物琼脂糖电泳，约500～3 000bp之间有一涂布均匀的DNA带谱（图2A），符合非哺乳动物RNA分布范围。第一链经酶切及分级分离后琼脂糖电泳见图2B。

　　2.1.4 cDNA与pBluescript II SK* 改良载体连接及重组质粒转化

　　定向插入cDNA片断（Sfi Ⅰ A→Sfi Ⅰ B）后，重组质粒转染感受态宿主菌，涂布于固体培养基培养，2个平板平均菌落数1128个，蓝斑56个。

　　2.2 cDNA文库质量评价

　　2.2.1 文库的重组率及容量

　　该cDNA文库的重组率及库容量分别为95.04%、1.13×106。

　　2.2.2 cDNA文库的PCR鉴定

　　随机选取12个阳性克隆进行PCR鉴定，结果显示插入片段平均长度为1.2kb（图3）。

　　2.2.3 5'EST测序、unigene归并及全长性分析

　　随机选取24个阳性克隆，5'端测序，去掉低质量及450bp以下的序列、屏蔽掉载体序列后获得23条有效序列，有效序列unigene归并，得到16条unigene，unigene比例为16/23×100%=69.56%；同时对序列进行全长分析，在23条序列中有17条序列有相关同源信息，结果为其中11条全长或可能全长，全长性比率为11/17×100％＝64.71％。

　　3 讨论
　　
　　CE作为重要的人畜共患寄生虫病，对人类健康以及畜牧业生产危害极大。但关于E.g.的基因组学研究尚未开展，到目前为止，在GenBank（NCBI）中仅有该物种230多条全长核苷酸序列，若不包括重复序列，实际只有几十个基因的序列资料。这与CE在全球及我国对人类健康及畜牧业生产的危害性不相匹配，不利于对相关基础问题的研究，更不利于相关疫苗、诊断试剂及药物的研究。而基因组研究需大量投入，在经费有限的条件下，构建全长cDNA文库是高效、大规模获得基因全序列信息并开展功能基因组研究的一条有效途径［2］。
　　
　　自1994年首个全长cDNA文库构建以来［3］，在全长cDNA文库构建方面已经取得了很大的进展，已成为发现新基因和研究基因功能的基本工具，全长cDNA文库的构建方法也不断涌现，如CAPture法［4］、Oligocapping法［5］ 、SMART法［6］ 和Capjumping法［7］等等。以上方法均着眼于真核生物mRNA 5'端的帽子结构，既有各自的独到之处，但也均存在一定的缺陷，在文库构建时应根据实验目的和实验室的工作条件选择适合的构建方法。已有多种寄生虫如疟原虫［8］、日本血吸虫［9］和华支睾吸虫［10］等通过构建全长cDNA文库开展功能基因组学研究。
　　
　　全长cDNA文库构建技术的出现，客观上促进了人们对基因结构和功能的认识。所谓全长cDNA是指那些不仅包含完整的阅读框架，还拥有完整5'和3'端非编码区的cDNA。全长cDNA文库的大多数克隆是全长的，因此能提供完整的mRNA信息，可通过基因序列比对获得mRNA剪接信息，还可对蛋白质序列进行预测，及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等，大大提高基因测序和生物信息学分析及基因功能研究的进程［11］。此外，全长cDNA文库是高效、大规模获得基因序列信息的有效途径，尤其是对基因组庞大，近期内尚不能进行全基因组测序的生物来说更是进行功能基因组研究的一条重要途径。
　　
　　本课题应用SMART法构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库，鉴定结果表明文库质量良好，为后期大规模5' EST随机消减测序获得大量EST和全长基因、丰富该物种的生物学信息，从中克隆、鉴定出一批重要的功能基因并开展该物种的功能基因组学研究奠定了基础。

参考文献

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