母血中游离CRH、PLAC1、SelectinP的mRNA表达水平与子痫前期的相关性研究

【摘要】 目的：比较孕妇血浆中胎盘来源的外周血促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、胎盘特异蛋白1(PLAC1)、 选择素P(SelectinP)基因的mRNA表达水平在子痫前期患者和正常孕妇之间的区别。方法：选择30例子痫前期病例(病例组)及40例正常孕妇(对照组)采集外周血提取RNA，分析上述3个基因的游离mRNA表达水平，并在两组间采用t检验比较。结果：CRH、PLAC1和SelectinP在病例组及对照组的孕妇外周血中均有表达，病例组孕妇外周血中CRH、PLAC1、SelectinP的表达水平明显高于对照组(P&<0.05)。结论：孕母血浆中的胎盘来源的游离CRH、PLAC1、SelectinP表达水平对于妊娠期高血压疾病，子痫前期的发病具有预测价值。

【关键词】 肾上腺皮质激素释放激素;胎盘特异蛋白;选择素P;基因;子痫前期

　　[ABSTRACT] Objective: To determine differences of concentrations of expression of mRNA of external corticotrophinreleasing hormone (CRH)， placenta specific1 (PLAC1) and selectinP gene between preeclamptic and normal pregnancies. Methods: Peripheral blood samples were obtained from 30 pregnant women with preeclampsia and 40 normal pregnant women. Plasma RNA was acquired and analyzed using reverse transcription polymerase chain reaction (PCR) assay. Median concentrations of CRH， PLAC1， and selectinP mRNA in plasma were compared with statistical ttest. Results: All pregnant women were found expression of mRNA of external CRH， PLAC1 and SelectinP gene， which were significantly higher in pregnant women with preeclampsia compared with normal pregnant women(P&<0.05). Conclusion: CRH， PLAC1， and SelectinP are distributed differently in pregnant women with and without preeclampsia， which are higher in pregnant women with preeclampsia and may be used as reference of diagnosis of preeclampsia.

　　[KEY WORDS] Corticotrophinreleasing hormone(CRH); PLAC1; SelectinP; Gene; Preeclampsia

　　子痫前期是妊娠期特有的疾病，随着妊娠的继续，疾病有加重的趋势;而妊娠结束、胎盘娩出后，疾病可以迅速得到控制[1]。子痫前期在我国孕产妇死亡的6大原因中居于第2位，高达7.6/10万，是威胁孕产妇和围生儿生命的严重疾病。而由此导致的早产、胎儿生长受限、小于胎龄儿，是围生儿死亡、导致伤残儿的重要原因之一。由于缺乏相应的分子标志物，子痫前期只能通过孕20周之后的临床表现来诊断[2]。一旦临床确诊以后病程发展迅速，常常在数天到数周之内发展到危重状态，丧失治疗机会。因此，如何早识别、早治疗是降低孕产妇死亡率、围生儿死亡率及伤残率的关键。

　　受肿瘤患者血浆和血清中发现大量游离肿瘤DNA的启发，首次证实了母体血浆和血清中存在较丰富的胎儿游离DNA后，许多学者纷纷转向了此项研究。有研究表明，子痫前期孕妇外周血中游离胎儿DNA水平存在异常变化。但胎儿游离DNA的识别大都必须依靠Y染色体特异性序列作为胎儿DNA标记物，这样使50%孕有女胎的妇女不能有效地得到无创伤性产前诊断。相对胎儿游离DNA而言，胎儿游离RNA则是非性别依赖的多态性的胎儿核酸标记物，而且它们提供胎儿组织基因表达的信息，使临床医生能够更好地监测胎儿生理及病理状态。胎盘源性mRNA含量丰富，具有极好的稳定性，且产后迅速清除，这些优点使胎儿游离mRNA成为妊娠相关疾病研究的重要手段[3]。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　选择2008年来我院妇产科就诊的子痫前期患者30例为病例组，年龄23～38岁，平均27.35岁，平均孕周36.5周;另选正常孕妇40例为对照组，年龄23～39岁，平均32岁，平均孕周36周。两组孕妇年龄，身高，体重及孕周等一般资料经检验差异无统计学意义(P&>0.05)，具有可比性。

　　1.2 方法

　　(1)样品制备:抽取7 mL肘静脉血于EDTA抗凝管中，分离血浆后使用Trizol(生工，上海)按照标准的RNA提取步骤提取总RNA，使用MLVREVERSE TRANSCRIPTASE(Invitrogen，美国)逆转录成cDNA待用。

　　(2) PCR引物设计：使用NCBI在线数据库检索获得CRH、PLAC1和SelectinP的mRNA序列，采用Primer Express 2.0软件设计Sybr Green荧光实时定量PCR的引物。引物序列为CRHF：GGCAGCTAGTGGTTCGGCC;CRHR：TCGCAGGCACCGGATGCTC;PLAC1F: ATTGGCTGCAGGGATGAAAG;PLAC1R:TTTGGGGTCTCCTGAAGATG; Selectin PF:GGACCTGGGTGGGAACAAATAAG; Selectin PR:TTGTAGAAG

　　CCACTGCACCACCCAAG;GAPDHF：GGTCGGAGTCAACGGATTTG;GAPDHR：ATGAGCCCCAGCCTTCT

　　CCAT，以上引物均在上海生工合成。

　　 (3)荧光定量PCR法检测:采用美国ABI公司生产的7500荧光定量PCR 仪。 SYBR Green Real time PCR Master Mix由Takara公司提供。克隆上述基因的目的片段后提取DNA，以10倍倍比梯度稀释(10～106拷贝数/μL)，制备标准曲线，以GAPDH浓度作为内参，通过样本RNA浓度梯度的log值对ΔCt值作图，获取3种基因的表达水平。PCR扩增条件为:2×Master SYBR Green I mixture12.5 μL，DNA模板3 μL，10 pmol/μL的上下游引物各1 μL， ddh3O 7.5 μL，总体积25 μL。PCR 循环条件为: 95 ℃预变性3 min，95 ℃ 20 s， 58 ℃ 20 s， 72 ℃ 30 s，共40个循环，于72 ℃时收集荧光信号。

　　1.3 统计学方法

　　采用SPSS13. 0系统软件进行处理。经过分析数据符合方差齐性要求，应用组与组之间t检验进行比较。检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 方法学评价

　　本组共70例孕妇参与研究，其中病例组30例，对照组40例。用RT PCR法对所有标本血浆游离mRNA进行检测，并使用GAPDH基因的mRNA作为内参，检测实验过程。各例标本中GAPDH组均有明显的扩增曲线，表明所有样本RNA提取和PCR扩增反应成功。

　　CRH、PLAC1、SelectinP及GAPDH基因的溶解曲线如图1所示，病例组和对照组的上述4个基因的PCR扩增产物溶解曲线均为单峰，没有形成引物二聚体等情况。

　　2.2 基因定量分析

　　两组孕妇外周血中CRH、PLAC1、SelectinP的表达水平如表1所示。结果显示病例组孕妇外周血中CRH、PLAC1、SelectinP的表达水平明显高于对照组(P&<0.05)。表1 两组CRH、PLAC1、SelectinP表达水平及比较

　　3 讨论

　　妊娠期母体外周血促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)主要来源于胎盘的分泌。胎盘分泌的CRH在灵长类动物和人类分娩发动中起重要作用，它可能直接或间接参与分娩发动过程。妊娠期间CRH维持低水平，分娩(包括早产及足月分娩)时显著增加并呈高亲和力状态。CRH能通过其受体促进胎盘、胎膜合成并释放前列腺素，后者可促进宫颈成熟并促进子宫收缩，在分娩发动机制中起重要作用。孕妇血浆中的游离CRHmRNA由胎盘释放到孕妇的外周血中，其浓度与胎盘中的表达水平变化相一致。国外研究表明，在子痫前期患者的胎盘组织中，CRH的mRNA表达水平明显升高，通常可以达到对照组的10倍以上，提示CRH与子痫前期病理过程相关[4]。

　　PLAC1是近年发现的属于X染色体编码的胎盘特异性基因，仅在妊娠期间由胎盘滋养层细胞表达。PLAC1可能在母胎界面形成中发挥作用，对于母胎界面的形成和稳定相关。国外研究表明，胎盘早剥的患者中PLAC1在孕妇外周血中的表达水平升高，且与疾病的发展有一定的相关性[5]。本研究发现子痫前期的患者其游离mRNA表达水平也升高，且与病程进展相关。

　　SelectinP为黏附分子选择家族的主要成员，通常储于血小板中的α颗粒、致密颗粒及血管内皮细胞的分泌颗粒(Weibel palade小体)中，可代表血小板黏附聚集功能在妊娠期间，选择素家族在母胎界面的细胞中表达。其中SelectinP介导Th1细胞向母胎界面的迁徙，激活血小板，释放血小板活化因子(PAF)，影响血栓形成，增强炎症反应，从而加重再灌注损伤，使细胞完整性和结构破坏，激活多核聚细胞(RMN)，黏附在受损的内皮细胞上，内皮功能更差，中性白细胞黏附增强使其更多地积聚于缺血的脑组织，导致微血管的堵塞和血管舒缩功能障碍，进一步加重损伤，影响胎儿生长发育。由于炎症反应是子痫前期的重要病理过程之一，SelectinP可能是在这一过程中起作用的因素。国外基因芯片的研究亦表明，在子痫前期孕妇的胎盘中SelectinP的表达水平显著升高[6]。因此，SelectinP有可能作为胎盘功能的反应，而成为判断子痫前期病情的指标之一。

　　孕妇外周血中可以检测到多种胎盘组织表达的mRNA[3， 7]。本研究进一步阐明CRH、PLAC1、SelectinP在子痫前期患者中上述3个基因的mRNA在孕妇外周血中表达水平明显升高，与相关文献相符合。此外，本研究还发现在子痫前期患者中上述3个基因的游离mRNA表达水平与正常对照组并无重叠。在所选取的30例子痫前期的患者中，上述3个基因表现出了与病程相关的趋势，尚需进一步加大标本量，增加实验分组予以证实。

　　综上所述，通过检测孕妇外周血中游离mRNA的表达水平，显示胎盘mRNA在子痫前期的孕妇外周血中表达水平明显升高，CRH、PLAC1、SelectinP等基因的mRNA定量分析对子痫前期发病具有预测价值。

参考文献

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　　2 Kang A， Struben H. Preeclampsia screening in first and second trimester[J]. Ther Umsch， 2008，65(11):663666.

　　3 Purwosunu Y， Sekizawa A， Okazaki S， et al. Prediction of preeclampsia by analysis of cellfree messenger RNA in maternal plasma[J]. Am J Obstet Gynecol， 2009，200(4): 386.

　　4 Ng EK， Leung TN， Tsui NB， et al. The concentration of circulating corticotropinreleasing hormone mRNA in maternal plasma is increased in preeclampsia[J]. Clin Chem， 2003，49(5):727731.

　　5 Farina A， Rizzo N， Concu M， et al. PLAC1 mRNA in maternal blood correlates with Doppler waveform in uterine arteries in normal pregnancies at the second and third trimeste[J]. Ann N Y Acad Sci， 2006，1075:130136.

　　6 Uszynski M， Uszynski W， Zekanowska E， et al. Pselectin in placenta and gestational myometrium: its measurements and hypothetical role in hemostasis of placental bed after labor[J]. J Perinat Med， 2008，36(3):213216.

　　7 Wang YQ， Li J， Yang Z. Expression of relaxin receptor in placental tissues of normal pregnancy and preeclampsia[J]. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi， 2008，43(4): 269271.