SMAF1基因的异位过表达对脂肪细胞3T3L1增殖和凋亡的影响

　　　　 作者：韩威 段佳慧 吴民泸 林泽超 刘彦华

【摘要】 目的 观察一脂肪细胞特异性表达的新基因小脂肪细胞因子1(SMAF1)在小鼠脂肪前体细胞3T3L1中的异位表达对脂肪细胞增殖和凋亡的影响。方法 构建小鼠SMAF1真核表达载体并稳定转染3T3L1脂肪前体细胞以获得永久异位表达SMAF1基因的细胞株，使用Western blot证实SMAF1基因的表达。体外培养SMAF13T3L1脂肪细胞，以MTT法检测SMAF13T3L1脂肪细胞的增殖;用流式细胞仪对SMAF13T3L1脂肪细胞进行凋亡分析。结果 与对照相比，SMAF13T3L1脂肪细胞增殖明显降低，差异有统计学意义(P&<0.05);而SMAF13T3L1脂肪细胞凋亡分析结果与对照无显著性差异。 结论 SMAF1基因在3T3L1中的异位性表达，对3T3L1前体脂肪细胞生长增殖有显著的抑制作用，而对细胞凋亡无影响，提示SMAF1在脂肪细胞增殖分化中发挥一定的作用。

【关键词】 SMAF1; 脂肪细胞; 异位表达; 增殖; 凋亡

　　 【Abstract】 Objective To evaluate the effect of a novel adipocytespecific expressed gene small adipocyte factor 1 (SMAF1) on proliferation and apoptosis of preadipcyte 3T3L1. Methods A permanent SMAF1 expression construct was established for stable transfection of 3T3L1 and formation of SMAF1 3T3L1 cell line. After invitro culturing of cells，both MTT method and flow cytometry were used to detect and analyze the proliferation level and apoptosis progress respectively. Results Compared with control groups，SMAF1 3T3L1 cell line showed remarkable reduction in proliferation with statistical significance (P&<0.05)，while no notable difference in apoptosis between two cell lines. Conclusion The ectopic expression of SMAF1 in 3T3L1 preadipocyte might suppress proliferation without interfering apoptosis process.【Key words】 small adipocyte factor 1; preadipocytes; ectopic expression; proliferation; apoptosis

　　肥胖症与遗传、中枢神经系统异常、内分泌功能紊乱、代谢因素和营养因素不平衡等密切相关。1994年Zhang 等成功克隆了肥胖基因(ob gene，现称为瘦素基因)，并发现其表达产物瘦素(leptin)[1];1995年，Tartaglia 等成功克隆了瘦素受体基因。迄今为止已陆续发现了许多对肥胖有决定作用的基因[2]。2005年，Ronald Kahn等发现了褐色脂肪细胞早期发育所必需的基因网络(374个基因)，并进一步证实了在胰岛素信号和褐色脂肪细胞控制之间存在着联系，这一基因网络的完整构成的发现，为肥胖症和糖尿病的临床检验和治疗提供了一个重要蓝图[3]。最近研究显示，在小鼠脂肪组织基因芯片筛选中，发现了一个异于其他蛋白质家族的具有约700碱基对/80氨基酸序列的潜在肥胖基因SMAF1——小脂肪细胞因子1(small adipocyte factor 1)[4]。SMAF1基因仅在脂肪细胞中特异性表达，在大鼠和小鼠培养的原代脂肪前体细胞中表达缺失;SMAF1基因表达和脂肪细胞基因表型呈现密切相关;不仅如此，SMAF1基因在脂肪细胞中的mRNA水平和脂肪细胞成熟分化程度呈正相关。但目前对SMAF1基因在脂肪细胞增殖和凋亡过程中所起的作用尚不清楚。本研究主要以SMAF1基因在体外前体脂肪细胞中的异位性表达来阐明SMAF1基因对脂肪细胞增殖和凋亡的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料前体脂肪细胞3T3L1购自美国American Type Culture Collection(ATCC)公司。DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国GIBCO公司。胰岛素、地塞米松、12甲基22异丁基黄嘌呤(MIX) 、G418 购自德国Sigma 公司。pCNLXGFP真核表达质粒购自美国Clonetech公司。限制性内切酶Hind Ⅲ和Bam HⅠ及T4连接酶均购自美国Invitrogen公司。 PCR试剂中Taq酶和dNTP购自美国PerkinElmer公司。稳定转染试剂盒Fugene购自美国Roche Molecular Biochemicals公司。Western blot试剂中，兔多克隆抗HA抗体和HRP标记的抗兔IgG单克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司;ECL显色剂购自美国Amersham公司。细胞生长检测试剂使用瑞士Roche公司生产的细胞增殖MTT试剂盒。细胞凋亡检测试剂CaspSCREENTM Flowcytometric Apoptosis Detection Kit购自美国BioVision公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养、分化诱导和鉴定 前体脂肪细胞3T3L1采用DMEM高糖培养基加入10%胎牛血清，在5%二氧化碳、37 ℃孵箱中生长，每两天换液1次。待细胞生长至完全融合后两天(d 0)，开始诱导分化，将培养液换成含0.5 mmol/L MIX、1 μmol/ L 地塞米松和5 mg/ L 胰岛素的鸡尾酒完全培养液; 48 h 后，撤去MIX 和地塞米松，使完全培养液中只含有5 mg/ L 胰岛素; 2 d后换液，撤去胰岛素，使用不含有任何诱导剂的完全培养基; 以后每2 d换液1次，直至第10 d 95%以上细胞已分化为成熟的脂肪细胞。

　　1.2.2 SMAF1真核表达质粒的构建和前体脂肪细胞的稳定转染 在SMAF1编码基因区设计引物并分别在Forward和Reverse端加入Hind Ⅲ和Bam HⅠ的酶切位点识破序列：F5′GAAAAGCTTGCCGCCATGAAGTACCCTCTGGTGCCTCTG3′; R5′ACAGGGATCCTCAAAGAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACCAGTGGAG

　　TCCGTCCTCCTCA3′。以小鼠白色脂肪组织中分离的cDNA作为模板，应用PCR扩增含有启动子ATG并加入HAtag序列的全长SMAF1基因。PCR产物经Hind Ⅲ和Bam HⅠ双酶切后插入pCNLXGFP表达质粒经转化、接种、抽提、测序鉴定正确后成为SMAF1pCNLXHA表达质粒。使用Fugene 6 作为稳定转染试剂将SMAF1pCNLXHA和阴性对照质粒转染3T3L1细胞，48 h 后用G418 筛选稳定表达细胞株后Western 印记验证SMAF1HAtag的蛋白表达。

　　1.2.3 细胞增殖和凋亡检测 稳定感染的SMAF13T3L1脂肪细胞株在100%达到生长融合点后再接种于96孔板中，密度为每孔5×102并在10% 胎牛血清和100 μg/ml的G418的培养液中培养(d 0)。未转染的阴性脂肪细胞在相同条件下培养。使用细胞增殖MTT试剂盒在Fluoskan酶标仪上机对细胞生长进行测定，每隔24 h 1次，连续 7 d。细胞凋亡检测采用流式细胞仪方法检测，即在脂肪细胞诱导分化后d 8 收集细胞并调整细胞数目为1×105/单位，按照厂家建议的操作步骤进行反应。最后上机(Coulter Flow Cytometry)在488/530 nm分析细胞caspase活性并得到细胞凋亡率(ratio)。

　　1.3 统计学处理采用统计软件SPSS 10.0 对数据进行t检验。数据以±s表示，以P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 SMAF1基因稳定表达脂肪细胞的鉴定为验证SMAF1基因是否正确转染到前体脂肪细胞，以保证SMAF1在3T3L1细胞中异位表达成功，本实验使用兔多克隆抗HA抗体进行Western蛋白印记法发现SMAF1基因在SMAF13T3L1前体脂肪细胞中高表达，而在由表达载体pCNLXGFP转染3T3L1前体脂肪细胞中未见表达提示稳定转染成功(见图1)。

　　2.2 SMAF1基因在3T3L1细胞中异位表达对前体脂肪细胞增殖的影响使用SMAF1pCNLXHA质粒稳定转染3T3L1细胞并筛选后接种于96孔培养皿，每隔24 h连续7 d应用MTT法对细胞增殖情况进行测定。结果表明试验组细胞生长速度比无SMAF1基因插入载体转染的对照组明显降低，提示SMAF1基因可能抑制前体脂肪细胞的增殖(见图2)。

　　2.3 SMAF1基因在3T3L1细胞中异位表达对前体脂肪细胞凋亡的影响稳定转染的SMAF13T3L1细胞系在用经典鸡尾酒分化诱导后开始镜下观察细胞形态。观察结果显示试验组和对照组细胞形态均无明显区别，均呈现细胞形状变圆，胞内脂滴出现并逐渐增多等脂肪细胞成熟化的现象。至分化第8 d收集细胞使用流式细胞仪对细胞凋亡程度进行分析，发现试验组和对照组细胞无显著性差异提示SMAF1基因对脂肪细胞凋亡在体外试验无显著作用(见图3)。

　　3 讨论

　　笔者建立了一个体外SMAF1异位表达3T3L1细胞株，旨在探讨SMAF1基因如何在分子水平调节和影响前体脂肪细胞分化增殖作用。作为一个新发现的潜在和肥胖有关的基因，SMAF1特异性在脂肪组织中表达而在前体脂肪细胞中表达缺失，同时其在体外培养的前体脂肪细胞分化过程中和PPARγ同步上调并大量表达[4]。 因此SMAF1基因完全可能对脂肪细胞增殖和分化过程中的分子信号传导有着特殊的作用，其功能是对脂肪细胞的生长、分化和能量代谢的影响，可能通过对诸多具有复杂信号通路的肥胖基因进行调控来实现。本研究发现SMAF1基因在3T3L1细胞中的异位表达能有效抑制3T3L1细胞的增殖而对细胞分化和凋亡未见有明显的抑制作用。 有报道证实，对于准备定向转化成成熟脂肪细胞的前体脂肪细胞，首先要从细胞周期中脱离出来才能再次接受脂肪分化因子的刺激，从而开始细胞分化[5]。前体脂肪细胞通常是在达到细胞生长融合点后通过细胞之间的相互作用，使细胞增殖发生停止现象[6]。而SMAF1基因的异位表达可能加大这种3T3L1细胞生长融合后的增殖终止现象，进而使得细胞重新进入细胞周期的G0/G1期。而其具体作用机理可能是部分地和脂肪细胞生长有关的信号通路产生作用从而抑制细胞的生长。其他研究证实，PPARγ在前体脂肪细胞中的异位表达能对脂肪细胞分化有明显的促进作用[7]。 PPARγ和具有高度亲和力的TZD协同作用而成为十分有效的脂肪细胞分化诱导剂。PPARγ在对数生长期中的NIH3T3和3T3L1 细胞中异位表达足以促使这些细胞生长停滞并能使这两种细胞发生脂肪细胞分化作用[8]。PPARγ不仅能够阻止脂肪细胞的生长，诱发细胞分化的开始，还能维持成熟脂肪细胞的分化表型，表明其在调解脂肪细胞分化过程中起到关键作用[9]。 对SMAF1基因的前期研究表明SMAF1基因序列中具有和胞核激素受体特异性结合的NRbox;其表达在脂肪细胞分化过程中递增并和包括PPARγ等其他脂肪细胞分化标志物和脂肪聚集呈同步效应提示SMAF1可能和PPARγ协同作用对脂肪细胞增殖产生影响。细胞凋亡主要是以胞核中DNA caspase为主要的生化指标。研究表明瘦素静脉注射后能剧烈上调PPARγ从而刺激脂肪细胞凋亡的启动[10]。而PPARγ又是脂肪细胞分化最重要的启动子之一。 SMAF1基因在3T3L1细胞中的异位表达对体外成熟脂肪细胞凋亡并无显著作用提示此基因可能尚未和PPARγ等转录基因协同作用影响脂肪细胞自然凋亡。综上所述，脂肪细胞增殖和凋亡受多种基因和因子的影响。机体通过各种基因/因子的相互促进或相互抑制调节脂肪细胞凋亡。SMAF1基因在脂肪细胞分化中所起作用还有待进一步研究证实，而此基因和脂肪细胞增殖的影响可能和肥胖有关，从而为肥胖的治疗提供了一个潜在的靶基因。

参考文献

1] Zhang Y，Proenca R，Friedman JM，et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue[J]. Nature，1994，372(6505):425432.

　　[2] Tartaglia LA，Dembski M，Tepper RI，et al. Identification and expression cloning of a leptin receptor，OBR[J]. Cell，1995，83:12631271.

　　[3] Gunton JE，Kulkarni RN，Kahn CR，et al. Loss of ARNT/HIF1b mediates altered gene expression and pancreatic islet dysfunction in human type 2 diabetes[J]. Cell，2005，122:337349.

　　[4] Kim JY，Tillison K，Smas CM. Cloning，expression，and differentiationdependent regulation of SMAF1 in adipogenesis[J]. Biochem Biophys Res Commun，2005，326(1):3644.

　　[5] Gregoire FM，Smas CM，Sul HS. Understanding by adipocyte differentiation[J].Phy Siol Rev，1998，78:783809.

　　[6] Ailhaud G，Dani C，Grimaldi P，et al. Coupling growth arrest and adipocyte differentiation[J]. Environ Health Perspect，1989，80:1723.

　　[7] Rosen ED，Sarraf P，Spiegelman BM，et al. PPAR Gamma is required for the differentiation of adipocyte tissue in vivo and in vitro[J]. Mol Cell，1999，4(4):611617.

　　[8] Tontonoz P，Speigelman BM，et al. Stimulation of adipogenesis in fibroblast by PPAR Gamma2: a lipidactivated transcription factor[J]. Cell，1994，79:11471156.

　　[9] Tontonoz P，Hu E，Graves RA，et al. mPPARgamma2: tissuespecific regulator of an adipocyte enhancer[J]. Genes && Dev，1994，8:12241234.

　　[10] Gnanalingham G，Mostyn A，Stephenson T，et al. Differential effects of leptin administration on the abundance of UCP2 and glucocorticoid action during neonatal development[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2005，289: E1093E1100.