蝙蝠葛酚性碱对BxPC3裸鼠的抑瘤作用及对bFGF表达的影响

　　　　作者：苏云明， 崔艳， 李薇婕， 李宜航， 刘坤， 孟丹， 章艳

【摘要】 目的 研究蝙蝠葛酚性碱(PAMD)对BxPC3裸鼠的抑瘤作用及对肿瘤新生血管bFGF表达的影响，进一步探讨其作用机制。方法 建立BxPC3裸鼠的动物模型，检测蝙蝠葛酚性碱对转移瘤的抑制率，同时应用SP免疫组织化学方法检测各组BxPC3裸鼠肿瘤组织bFGF的表达水平。结果 蝙蝠葛酚性碱对BxPC3裸鼠瘤组织具有抑制作用，高、中、低剂量组抑瘤率分别为34.91%、52.83%、41.51%，与模型对照组比较具有统计学意义(P&<0.01);各剂量均能明显降低BxPC3裸鼠瘤组织bFGF的表达水平。结论 蝙蝠葛酚性碱对BxPC3裸鼠肿瘤具有明显的抑制作用，其机制可能是通过改善裸鼠免疫功能，抑制肿瘤新生血管形成来实现的。

【关键词】 蝙蝠葛酚性碱; bFGF; 免疫组织化学; BxPC3

　　【Abstract】 Objective To explore the effects of phenolic alkaloids from menispermum dauricum(PAMD)on tumor inhibitory and expression of basic fibroblast growth factor(bFGF)in BxPC3 nude mice and to further investigate its protective mechanism for pancreatic carcinoma.Methods The metastatic tumor model of nude mice was established with BxPC3 cell line.After PAMD treatment，the inhibition rate of tumor proliferation was detected and immunohistochemistry was carried out to confirm the expression of bFGF in nude mice.Results PAMD could inhibit the tumor growth in nude mice of BxPC3 cell line and the inhibition rate with high，middle and low dose PAMD was 34.91%，52.83%，41.51%，respectively(vs control group，P&<0.01).Meanwhile，PAMD could apparently inhibit the expression of bFGF in the tumor.Conclusion PAMD shows conspicuous inhibitory action on the tumor growth of nude mice，which possibly due to its potency to improve immune function and inhibit tumor angiogenesis in nude mice.

　　【Key words】 phenolic alkaloids from menispermum dauricum;basic fibroblast growth factor;immunohistochemistry;BxPC3

　　胰腺癌(pancreatic carcinoma，PCa)是一种全球范围的消化道恶性肿瘤[1]，为欧美第四大癌症死亡原因[2]，且胰腺癌对放疗化疗不敏感[3]，预后远远不能令人满意，其总体的5年生存率仍低于5%，每年的胰腺癌新发病例数与死亡病例数几乎相等[4]。蝙蝠葛酚性碱(phenolicalkaloids of menispermum dauricum，PAMD)是从防己科植物北豆根(menispermum dauricum)的干燥根茎中提取的多种脂溶性生物碱的混合物，其主要成分为蝙蝠葛碱(dauricine，Dau) 和蝙蝠葛苏林碱(daurisoline，Ds)。蝙蝠葛酚性碱具有抗高血压、抗动脉粥样硬化、抗缺血性心律失常、抑制血小板黏附及聚集、抗血栓形成、抗脑缺血、抗氧化等作用[510]，但关于蝙蝠葛酚性碱抗肿瘤作用尚未见报道。本实验采用胰腺癌BxPC3细胞株建立裸鼠胰腺癌模型，观察蝙蝠葛酚性碱的抑瘤作用及其对肿瘤新生血管bFGF表达的影响，探讨其抗肿瘤作用机制及在肿瘤治疗中的应用价值。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　裸鼠40只，体重18～22 g，雌雄各半，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供，合格证:SCXK(京)20070001.

　　1.2 药物与试剂

　　蝙蝠葛酚性碱(PAMD)由黑龙江中医药大学药学院王栋教授提供，PAMD含量为83%，先以1 mol/L HCl溶解后，再用1 mol/L NaOH调pH值至中性，加蒸馏水至所需浓度。注射用环磷酰胺(cyclophosphamide for injection)，江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H32020857.

　　胰腺癌瘤株BxPC3由中国科学院上海生科院细胞资源中心提供。生理盐水，哈药集团制药六厂，批号:071003B11.bFGF兔抗鼠多克隆抗体、山羊抗兔IgG抗体HRP多聚体、SP9003检测试剂盒、PV6001两步法检测试剂盒、DAB显色剂均由南京建成生物工程研究所提供。

　　1.3 主要实验仪器

　　生物组织包埋机(湖北孝感);电热恒温培养箱DPX9162B1;轮转式组织切片机俫佧2135型;研究用生物显微镜Olympus BX60;电子天平(AL204，METTLEY TOLEDO，Switzerland);超净工作台BIOLOGICAL Safety Cabinets ClassII Nikon digital camera DXm1200F HⅢE600;格兰仕中型机型微波炉WP700.

　　1.4 动物模型的制造

　　取冻存的胰腺癌细胞株BxPC3，立即投入37℃水中，1 min内融化，然后离心去除冻存液，用约10倍的冷RPMI1640完全培养液洗1次，接种于培养瓶中，待细胞贴壁后更换培养液。肿瘤细胞株培养在RPMI1640完全培养液中，置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中，隔日换液，细胞长成单层后，用0.25%胰酶EDTA消化、传代。待细胞进入对数生长期后，收集细胞并用RPMI1640完全培养基调整浓度为5×106个/ml的细胞悬液备用。在无菌条件下接种于40只裸鼠右腋窝皮下，每只鼠接种0.2 ml(含瘤细胞数1×106个)。

　　1.5 分组及给药方法

　　裸鼠40只造模后随机分为5组，每组8只，分别为蝙蝠葛酚性碱高、中、低剂量组，模型对照组及环磷酰胺对照组(阳性对照组)。各组均腹腔注射给药，每日给药剂量为蝙蝠葛酚性碱高剂量20 mg/kg，中剂量10 mg/kg，低剂量5 mg/kg，模型对照组组每日给予同等容积生理盐水，阳性对照组注射用环磷酰胺156 mg/kg(每周给药1次)，连续21 d.

　　1.6 实验指标的检测方法

　　停药后次日称取小鼠体重，脱椎处死小鼠，取瘤块称重，计算抑瘤率。

　　抑瘤率(%)=对照组平均瘤重-实验组平均瘤重对照组平均瘤重×100%

　　免疫组化法(SP)检测肿瘤组织bFGF表达情况。检测以细胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，同一显微镜倍数(×40)观察全片，确定肿瘤浸润边缘;然后选择5个高倍(×400)视野，取所分析的5个不同视野染色细胞平均百分数及平均染色强度评分，评分标准按Mattern[11]的方法进行:根据着色细胞的比例(染色范围)及染色强度，染色范围(阳性细胞比率)分为0～4级，阴性为0分;阳性细胞1%～25%为1分;阳性细胞26%～50%为2分;阳性细胞51%～75%为3分;阳性细胞76%～100%为4分。染色强度划分为0～3级:无色为0分;弱阳性(黄色)为1分;中等强度(棕黄色)为2分;强阳性(棕褐色)为3分，两者得分相加为最后评分。

　　1.7 统计方法

　　结果采用SPSS 11.5 for Windows统计软件分析处理，抑瘤实验结果组间比较采用t检验，所得数据以均数±标准差表示。bFGF免疫组化检测结果采用秩和检验，以P&<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 蝙蝠葛酚性碱对BxPC3裸鼠体内抑瘤实验结果

　　表1显示，蝙蝠葛酚性碱高、中、低剂量组和环磷酰胺对照组同模型组相比较，对BxPC3实体瘤均有不同程度的抑制作用，抑瘤率分别为34.91%、52.83%、41.51%、55.66%，并与模型组比较其差异有统计学意义(P&<0.01)。表1 蝙蝠葛酚性碱对BxPC3裸鼠体内抑瘤实验结果

　　2.2 蝙蝠葛酚性碱对BxPC3裸鼠瘤组织中bFGF表达的影响

　　表2免疫组织化学结果显示，bFGF在模型组瘤组织呈高表达，各实验组和模型组肿瘤组织bFGF的表达水平均较模型组有所降低;其中蝙蝠葛酚性碱中、低剂量组和环磷酰胺对照组的bFGF表达水平显著降低，与模型组比较差异有统计学意义(P&<0.01);蝙蝠葛酚性碱高剂量组也能降低bFGF的表达，与模型组比较差异有统计学意义(P&<0.05)。表2 蝙蝠葛酚性碱对BxPC3裸鼠瘤组织中bFGF表达的影响

　　3 讨论

　　抑瘤实验结果表明，蝙蝠葛酚性碱高、中、低剂量组BxPC3小鼠的平均瘤重均明显低于模型对照组(P&<0.01)，抑瘤率分别为34.91%、52.83%、41.51%，抑瘤率均大于30%，符合《现代肿瘤治疗药物学》关于抗肿瘤中草药有效性的标准(抑瘤率&>30%)，因此可初步认为蝙蝠葛酚性碱对胰腺癌细胞株BxPC3裸鼠皮下异位移植瘤有抑制作用。

　　在许多肿瘤组织中bFGF呈高表达，并且其水平的高低与肿瘤的某些生物学行为有密切关系[12]。bFGF作为一种生长因子，由于具有促进多种细胞生长和繁殖以及促血管生成等作用，与肿瘤的生长、增殖密切相关[13]。bFGF的过度表达在胰腺癌微血管生成过程中起重要作用，提示两者及其受体可作为抗血管生成以治疗胰腺癌的靶点，或监测疗效的指标。

　　本实验结果表明，蝙蝠葛酚性碱够下调BxPC3裸鼠肿瘤组织中bFGF表达水平，说明蝙蝠葛酚性碱可能是通过抑制bFGF的表达从而抑制肿瘤血管生成而实现抑瘤作用的。

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