作者：王浩宇 安峰 吴靖芳 任君旭
【摘要】 目的：研究地塞米松对胎鼠腭突中嵴上皮(Medial Edge Epithelium，MEE)细胞凋亡、增殖和分化的影响，以探讨地塞米松引起腭裂畸形的发病机制。方法：以醋酸地塞米松诱导胎鼠腭裂畸形，应用免疫组化法和图像分析研究MEE细胞中 bcl-2和p53基因在不同时期中实验组与对照组的表达情况。结果：实验组在GD13.5~16.5(GD，gestation day)MEE细胞的bcl-2 与p53表达总体维持增高趋势;GD13.5 MEE细胞的bcl-2 与p53表达实验组与对照组均无明显差别;GD14.5 MEE细胞的bcl-2与p5表达实验组明显多于对照组(P&<0.01)。结论：地塞米松诱发腭裂出现MEE细胞凋亡减少，通过改变MEE细胞中bcl-2和p53基因的表达而实现对MEE细胞增殖与凋亡的调控是地塞米松引起腭裂可能机制之一。
【关键词】 bcl-2，p53;腭裂;腭突中嵴上皮;细胞凋亡
【ABSTRACT】Objective:To study the effectiveness and of dexamethasne(DEX)on the Apoptosis，differentiation and proliferation of mouse palatal medial edge epithelial(MEE)cells and its pathogenesis.Methods:The cleft palate of mice were obtained by injecting intraperitioneally with DEX acetate.The different periods expression of bcl-2 and p53 gene induced by DEX in embryonic palatine process tissues of experimental group and that of control group were detected by hybridization in situ.Results:In the experimental group of gestation day(GD)13.5 to 16.5，the positive index of bcl-2 and p53 become higher;On GD 13.5 the signal was not significantly different between the experimental group and the control group;On GD 14.5 the signal was significantly higher in experimental group than that in control group.Conclusion:DEX can lead to remarkable cell apoptosis decrease in mouse palatal shelves，the expression of bcl-2 and p53 play an important role in regutating MEE cells apoptosis.
【KEY WORDS】Bcl-2，p53，Cleft palate，Medial Edge Epithelium，Apoptosis
胚胎腭的发生发育是一系列连续、复杂的生物学过程，在这一系列复杂的过程中，细胞增殖与凋亡时刻发生并且关系紧密。细胞程序性死亡((programmed cell death，PCD)是保持机体细胞数目正常的一种内环境稳定机制，bcl- 2基因是目前公认的抗PCD基因，它广泛存在于哺乳动物胚胎组织中，而p53基因也是最近研究最透彻、功能最强大的一种抑癌基因。本研究采用免疫组化方法检测胚胎腭发育过程，比较腭突中嵴上皮(MEE)细胞bcl-2和p53基因表达变化，以及地塞米松对其表达的影响，探讨bcl-2和p53基因在地塞米松诱发胎鼠腭裂中的作用。
1材料和方法
1.1动物健康成年未生育小鼠雌雄比例2∶1，体重为22～25g(北京大学医学部实验动物中心)。
1.2组织学标本的制备
地塞米松致腭裂动物模型的建立[1]，分别于孕期GD13.5，GD14.5，GD15.5和GD16.5(GD，gestation day)剖腹取胎，选取实验组腭裂胎头和对照组正常胎头，用Bouin液固定，石蜡包埋，连续切片(厚5μm)，将切片进行免疫组织化学染色。
1.3试剂
醋酸地塞米松注射液(华北制药集团)，兔bcl-2和p53多克隆抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒、Tris-HCL缓冲液、0.01mol/L PBS液(武汉博士德生物工程有限公司)，DAB试剂(上海试剂一厂)等。
1.4免疫组化染色
常规脱蜡至水;抗原修复液修复约3min;0.01mol/L PBS液洗3min×3次;3%h3O2室温避光孵育15min;0.01mol/L PBS液洗3min×3次;5%BSA封闭。加入稀释(1∶100)的bcl-2或p53，湿盒中4℃孵育过夜。其他步骤按即用型SABC免疫组化试剂盒使用说明进行。盐酸-酒精分化、自来水蓝化、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
1.5图像分析及统计学处理
将免疫组化染色图像输入Motic Med 6.0数码医学图像分析系统，经减除背底、选删除后，测量MEE细胞阳性着色的面密度，然后根据实验组和对照组的相应部位的平均面密度和标准差作t检验分析。所有数据以(x±s)表示。
2结果
2.1正常对照组MEE细胞中bcl-2和p53表达情况
在整个腭的发育过程中bcl-2与p53均有表达，bcl-2阳性信号分布在胞膜、胞浆和核膜上，呈棕黄色颗粒(见图5);p53阳性信号分布在细胞核内，呈棕黄色颗粒(见图1)。GD13.5~14.5中bcl-2与p53均有下降趋势，GD15.5后正常胚胎双侧腭突融合，因此MEE细胞完全消失(见图2、6)。
2.2地塞米松对鼠胚MEE细胞中bcl-2表达的影响
GD13.5~16.5中MEE细胞中bcl-2表达呈增高趋势，GD13.5与14.5、GD14.5与15.5、GD15.5与16.5两两比较均为P&<0.01，差异具有统计学意义;GD13.5实验组与对照组比较差异无统计学意义;GD14.5实验组与对照组比较P&<0.01，差异具有统计学意义(见表1);GD15.5和GD16.5MEE分化为复层上皮(见图3、4)。
2.3地塞米松对鼠胚MEE细胞中p53表达的影响
GD13.5~16.5中MEE细胞中p53表达呈增高趋势，GD13.5与14.5、GD14.5与15.5、GD15.5与16.5两两比较均为P&<0.01，差异具有统计学意义;GD13.5实验组与对照组比较差异无统计学意义;GD14.5实验组与对照组比较P&<0.01，差异具有统计学意义(见表1);GD15.5和GD16.5MEE分化为复层上皮(见图7、8)。图1对照组GD14.5双侧腭突融合后，MEE细胞的p53表达较弱，在中线部位形成一条细胞索图2对照组GD15.5双侧腭突融合，MEE细胞已消失图3、7实验组GD15.5腭突短小，MEE细胞层数增多图4实验组GD16.5一侧腭突相接触，但MEE已经变为复层上皮图5对照组GD14.5双侧腭突融合后，MEE细胞的bcl-2表达较弱，在中线部位形成一条细胞索图6对照组GD15.5一侧腭突正在融合图8实验组GD16.5MEE细胞层数变为复层上皮表1DEX对各期鼠胚MEE细胞bcl-2与p53基因表达的影响
3讨论
糖皮质激素类物质可引起腭发育畸形已众所公认，但其致畸机制尚不清楚。为探究其机制，许多学者将目光放在了对MEE细胞的研究上[2-3]，目前普遍认同的观点认为正常MEE细胞的最终转归包括两种形式，一是退化或死亡：MEE细胞在侧腭突融合时以程序性细胞死亡( PCD)的形式消失。二是上皮-间充质转化：MEE细胞转化为一种间充质细胞。
为研究地塞米松对MEE细胞凋亡、增殖和分化的影响，本实验通过组织切片免疫组化染色对比bcl-2 和p53在实验组与对照组的表达情况。bcl-2是最重要的凋亡抑制基因，最早由Tsujimoto(1985)从伴有14，18染色体易位的淋巴瘤细胞中发现，Kondo 等[4]认为bcl-2是细胞内膜相关蛋白的家族成员，其调控着细胞程序性死亡。bcl-2基因可以使细胞存活时间延长，而对细胞的增殖没有明显影响，同时抑制多种组织的细胞凋亡。而p53是当今研究最为广泛的人类肿瘤抑制基因，Yonish等[5]研究表明p53蛋白分为野生型和突变型两种亚型。野生型p53有修复DNA避免突变和诱导细胞凋亡的作用，而突变型p53没有该作用，失去抑癌作用，抑制凋亡[6]。
本研究结果显示，GD13.5对比实验与对照组均无差别，由此可推断此时期，MEE细胞正处于激活早期，凋亡与增殖机制尚未体现规律。而在GD14.5实验组MEE细胞的bcl-2和p53表达明显高于对照组(P&<0.01)，提示其高表达可能使MEE细胞缺少增殖过程中推动周期正向进行的动力，导致细胞的增殖抑制，细胞转而选择另一条路程序性死亡来应答外界的刺激。在对bcl-2的研究中，Cleaxy 等[7]认为，bcl-2基因是通过抑制多种细胞凋亡的因素来抑制细胞凋亡的。李伯友等[8]通过EPM 细胞体外培养中证实，地塞米松对EPM 细胞外基质合成及EPM 细胞增殖的均有抑制作用。而在实验组GD15.5~16.5，bcl-2和p53继续维持高表达，并可观察到MEE细胞层数增多，最终变为了复层上皮。Rodrigo等[9]最近研究认为MEE细胞的凋亡是腭突融合的首要条件，并且只有在两侧腭突接触之后，才会出现MEE细胞的凋亡。因此可以推断地塞米松诱导致畸使细胞凋亡受抑制，而致MEE细胞有着不恰当的存活，或MEE细胞向上皮-间充质转化过程受阻，最终形成腭裂。朱江波等[10]对甲基亚硝基胍致小鼠腭裂机制的研究中也有相似的结论。
因此在小鼠腭突发育过程中给予大剂量的地塞米松，可抑制腭突生长并导致腭裂，这可能是因为地塞米松作用于腭突后，通过影响MEE细胞中凋亡与增生的平衡关系，出现MEE细胞凋亡减少，而MEE细胞的持续存在使双侧腭突抬起后相接触形成的上皮条索不能崩解，两腭突间充质不能接触融合，最终导致腭裂畸形发生。
参考文献
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7Cleaxy ML，Smith SD，Sklar J.Cloning and structural analysis of cDNAs for bcl22 and a hybrid bcl22 immunoglobulin transcript resulting from the t(14;18)\[J\].Science，1998，147 (1):19-28.
8李伯友，李宏礼，傅豫川，等.地塞米松对小鼠胚胎腭突间充质细胞增殖的影响\[J\].临床口腔医学杂志，2002，18(1)： 10-12.
9Rodrigo C，Concepcion V，Roshantha AS，et al.Programmed cell death is required for palate shelf fusion and is regulated by retinoic acid\[J\].Dev Biol，2002，245：145-156.
10朱江波，印木泉，赵海涛，等.甲基亚硝基胍致小鼠腭裂的分子机制\[J\].毒理学杂志，2005，19(3)：181-184.