作者：乔海霞 张彦霞 李艳鹏 甄攀 张玉妥
【摘要】 目的：研究吴茱萸乙醚提取物、正丁醇提取物、挥发油、水提物对绿脓杆菌的抑菌作用。方法：用乙醚脱脂，得乙醚提取物;将乙醚脱脂后的吴茱萸用70%乙醇提取，正丁醇萃取，得正丁醇提取物1、2、3;用挥发油提取器提取挥发油;用蒸馏水加热回流法提取水提物。用以上提取物分别进行抑菌试验。测定吴茱萸正丁醇提取物1、2中的总皂苷、总黄酮的含量。结果：试验表明正丁醇提取物1、2、3和残渣均在31.25mg/mL时对临床绿脓杆菌仍有抑菌作用;挥发油在1.25%时对临床绿脓杆菌仍有抑菌作用;乙醚提取物对标准绿脓杆菌的MIC为250mg/mL，对临床绿脓杆菌的MIC为125mg/mL;水提物对标准绿脓杆菌无抑制作用，对临床绿脓杆菌的MIC为125mg/mL。正丁醇提取物1、2的总皂苷含量测定结果为28.71%、31.27%;总黄酮的含量分别为43.25%、44.31%。结论：研究提示正丁醇提取物1、2、3和残渣及挥发油对绿脓杆菌有明显的抑菌作用，四者之间的抑菌作用没有显著性区别。水提物和乙醚提取物对绿脓杆菌有抑制作用，抑菌作用比正丁醇提取物、残渣和挥发油的作用弱。
【关键词】 吴茱萸;1-丁醇;假单胞菌/铜绿;乙醚提取物;正丁醇提取物;挥发油;水提物;微生物敏感性试验
【ABSTRACT】Objective:To study the antibacterial function of rutaecarpa ether extract，n-butanol extract，volatile oil and aqueous extract.Methods:Ethyl ether extract was obtained by skimming ether，and rutaecarpa defatted with ether was extrated by 70% ethanol，then n-butanol extracts 1，2，3 were got;volatile oil was collected with volatile-oil extractor，and water extract was abstrated by distilled water heating reflux extraction methods.All above extracts were put into studies of antimicrobial studies.Fotal saponins，and flavonoids contents in rutaecarpa 1，2 n-butanol extract were determined.Results:The experiments showed that the n-butanol extract 1，2，3，and its residues in 31，25mg/mL were still bacteriostasis for clinical Pseudomonas aeruginosa and 1.25 percent of volatile oil had anti-bacteria furction for clinical Pseudomonas aeruginosa;the extract rate for ether to MIC of standard Pseudomonas aeruginosa was 250mg/mL，to MIC of chinical Pseudomonas aeruginosa was 125mg/mL;water extract had no effectiveness to MIC of standard Pseudomonas aeruginosa and to MIC of clinical Pseudomonas aeruginosa at 125mg/mL.The total saponins contents determined in 1，2 n-butanol extract were 28.71%，31.27%;and the total contents of flavonoids were 43.25%，44.31% respectively.Conclusion:The experiments show that 1，2，3 n-butanol extract and its residues and volatile oil had apparent antibacteria function to Pseudomonas aeruginosa significantly，and among the four extracts，there is no significant difference in Bacteriostasis.Water extract and ether extract have bacteriostasis to Pseudomonas aeruginosa，but the function is weaker than that of n-butanol extract and volatile oil residues.
【KEY WORDS】Evodia rutaecarpa，1-Butanol，Pseudomonas aeruginosa，Ether extract，N-butanol extract，Volatile oil，Water extract，Microbial sensitivity tests
吴茱萸[Evodiaru taecarpa (Juss.) Benth]又名淡茱萸、吴萸，是芸香科植物吴茱萸接近成熟的果实，有小毒，临床上多炮制后入药。具有强心、扩张血管、镇痛、驱蛔虫等作用，可以用于治疗高血压、头痛、胃肠紊乱、腹泻、霍乱等疾病，同时对产后身体系统失调具有良好的系统调节作用[1]，据报道[2]吴茱萸有一定的抑菌作用。
随着抗生素广泛及不合理的应用，带来了许多负面效应，如医院感染率上升及产生耐药现象等。中药在解决细菌耐药性方面具有独特功效，且有安全、高效等优势。已证实多种中药的有效成分有抑菌或抗菌作用[3]。有的中药可通过提高机体的免疫力、降低抗生素的毒副作用、增强抗菌药物的作用等间接地体现其抗菌或抑菌作用。我们前期实验结果提示吴茱萸提取物对铜绿假单胞菌敏感[4]，因此，我们进一步研究吴茱萸不同提取物对铜绿假单胞菌的抑制作用及其抑制铜绿假单胞菌的有效部位。
1材料与方法
1.1仪器与试药
1.1.1仪器UV754N紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司制造)。
1.1.2试药吴茱萸：由河北北方学院中医系鉴定。人参皂苷Re(中国药品生物制品检定所提供，110754-200421)。芦丁(天津一方科技公司提供)。香草醛、浓硫酸、铁氰化钾、三氯化铁、盐酸、正丁醇、乙醇、乙醚、十二烷基硫酸钠等均为分析纯试剂。
1.2吴茱萸提取物抑菌试验
1.2.1各种提取物的制备
1.2.1.1乙醚提取物称取吴茱萸粉末700g，按照乙醚提取方法[5]，将乙醚提取液蒸馏至无乙醚味，残余物即为吴茱萸脂溶性成分。
1.2.1.2正丁醇提取物将上述脱脂后的吴茱萸挥干乙醚，用70%乙醇液2 400mL浸泡12h，于86℃水浴加热回流提取2h，重复提取3次。在此提取阶段得到三种提取物1，2，3[5]。此三种提取物均在烘箱中于80℃烘干至无正丁醇味。
1.2.1.3残渣吴茱萸用70%乙醇提取，提取液用正丁醇萃取后剩余的残液中的沉淀物，抽滤，80℃烘干至无正丁醇味，即为残渣。
1.2.1.4水提物取20g吴茱萸粉末，用450mL水浸泡，加热回流提取。重复提取2次，提取液合并，抽滤，减压浓缩至2g/mL生药。
1.2.1.5挥发油用挥发油提取器提取。200g吴茱萸用1500mL水浸泡，加热回流提取6h。如此重复提取1次，共得1.5mL挥发油。
1.2.2各种提取物浓度配置
1.2.2.1正丁醇提取物1、2、3和残渣各称量2g，加4mL蒸馏水，制成0.5g/mL溶液，灭菌后备用。
1.2.2.2乙醚提取物用无菌乙酸乙酯配制成1g/mL溶液，灭菌后备用。
1.2.2.3吴茱萸水提物用无菌蒸馏水稀释成0.5g/mL溶液，灭菌后备用。
1.2.2.4挥发油用乙酸乙酯5倍稀释，灭菌后备用。
1.2.3各种提取物的抑菌试验
1.2.3.1正丁醇提取物1、2、3和残渣的抑菌试验
正丁醇提取物1、2、3和残渣的灭菌溶液用无菌肉汤倍比稀释，终浓度分别为0.375、0.250、0.125、0.062 5、0.031 25g/mL。每支试管各加0.1mL绿脓杆菌菌液，培养24h后观察结果，将各试管的培养物接种至M-H培养基的平板上，确定是否有细菌生长。37℃，24h观察结果，以琼脂平板上完全无细菌生长的药物最高稀释度为最低抑菌浓度(MIC)。通过MIC记录抑菌结果(见表1)。
1.2.3.2乙醚提取物的抑菌试验
用无菌肉汤倍比稀释，终浓度分别为0.75、0.50、0.25、0.125、0.062 5g/mL，每支试管各加绿脓杆菌0.1mL菌液，培养24h操作同上记录抑菌结果(见表2)。
1.2.3.3水提取物的抑菌试验
用无菌肉汤倍比稀释，终浓度分别为0.375、0.250、0.125、0.062 5、0.031 25g/mL。每支试管各加绿脓杆菌0.1mL菌液，培养24h操作同上记录抑菌结果(见表3)。
1.2.3.4挥发油的抑菌试验
用无菌肉汤倍比稀释至所需浓度。抑菌结果(见表4)。
1.3含量测定
对正丁醇提取物1、2、3分别进行了总皂苷和总黄酮的含量测定[6-7](见表5)。
2结果
表1正丁醇提取物和残渣对临床绿脓杆菌抑菌结果表2乙醚提取物对标准和临床绿脓杆菌抑菌结果表3水取物对标准和临床绿脓杆菌抑菌结果表4挥发油对临床绿脓杆菌抑菌结果表5吴茱萸正丁醇提取物1、2、3中总皂苷、总黄酮的含量
3结论
研究结果提示正丁醇提取物1、2、3和残渣对绿脓杆菌有明显的抑菌作用，在试验范围之内四者之间没有显著性区别;吴茱萸挥发油对绿脓杆菌有显著的抑制作用;水提物和乙醚提取物对绿脓杆菌有抑菌作用，但抑菌作用相对较弱。正丁醇提取物1、2、3和残渣都是经70%乙醇提取得到的，所以吴茱萸抑制绿脓杆菌的有效部位可能是70%乙醇提取物和挥发油。
4讨论
铜绿假单胞菌俗称绿脓杆菌，是非发酵菌中最具临床意义的细菌，也是 临床标本中最多见的假单胞菌。由于多年来抗生素的滥用，使得铜绿假单胞菌产生了高感染率，高耐药性以及难以治疗、死亡率高等特点[8]。有报道指出，铜绿假单胞菌对目前临床应用的100多种抗生素均显示抗药性，是对人类生命造成威胁的3种细菌之一[9]，因此临床迫切需要新的药物来控制绿脓杆菌引起的感染。
我们前期的试验表明吴茱萸具有广谱抗菌作用，本试验得出正丁醇提取物1、2、3和残渣、挥发油对绿脓杆菌均有较强的抑制作用;乙醚提取物和水提物对临床绿脓杆菌有抑菌效果，但相对较弱。提示吴茱萸抑制绿脓杆菌的有效部位可能是70%乙醇提取物和挥发油。我们将进一步研究70%乙醇提取物和挥发油对大量临床耐药绿脓杆菌的抑菌效果。
含量测定结果显示，正丁醇提取物1、2、3中总皂苷的含量分别为28.71%、31.27%、30.83%;总黄酮的含量分别为43.25%、44.31%、43.93%。含量相差不大，对绿脓杆菌的抑制作用也相似，在下一步研究中，这三部分提取物可以合并使用。鉴于以上结果我们将进一步研究70%乙醇提取物和挥发油对大量临床耐药绿脓杆菌的抑菌效果。
参考文献
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2覃筱燕，张淑萍，杨林，等.复方双花口服液的解热、抗炎、抑菌作用的实验研究\[J\].中央民族大学学报：自然科学版，2003，12(4)：315.
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4乔海霞，甄攀，李秀娟，等.吴茱萸提取物体外抗菌作用的初步研究\[J\].河北北方学院学报：医学版，2009，26(1)：27.
5甄攀，史国如，张卫，等.吴茱萸提取物体的抗氧化作用\[J\].河北北方学院学报：医学版，2010，27(1)：21-23.
6张颖，甄攀.吴茱萸中总皂苷、总黄酮和总酚酸的含量测定\[J\].河北北方学院：自然科学版，2008，24(3)：82.
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8Bennett JV.Nosocomial infections due to Pseudomonas\[J\].J Infect Dis，1974，130(S):4-7.
9Robert JS.A three-year study of nosocomial infections associated with Pseudomonas aeruginosa\[J\].J Clin Microbiol，1983，18(1):160-164.