作者：肖贞良，全燕，李福祥，钱桂生
【摘要】 目的 探讨脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子α(TNFα)对大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)内游离钙浓度([Ca2+]i)的影响。方法 将细胞接种于盖玻片上，细胞单层汇合后进行实验。实验分组：LPS组(用10μg/ml LPS)，LPS+山莨菪碱组(用10μg/ml LPS+10μg/ml山莨菪碱)，TNFα组(用5000u/mlTNFα)，TNFα+山莨菪碱组(用5000u/ml TNFα+10μg/ml山莨菪碱)，正常对照组加等量稀释液。作用15、90min后按照试剂盒提供的方法，并参照文献测定[Ca2+]i。结果 与正常对照组比较，LPS组、LPS+山莨菪碱组15min和90min两个时相点[Ca2+]i均显著升高(P&<0.01);LPS组与LPS+山莨菪碱组比较，15min和90min两个时相点[Ca2+]i无明显差异(P&>0.05)。同样，与正常对照组比较，TNFα组、TNFα+山莨菪碱组15min和90min两个时相点[Ca2+]i均显著升高(P&<0.01);TNFα组与TNFα+山莨菪碱组比较，15min和90min两个时相点[Ca2+]i无明显差异(P&>0.05)。结论 LPS、TNFα作用可使RPMVEC [Ca2+]i显著升高，山莨菪碱对LPS、TNFα诱导的RPMVEC [Ca2+]i升高无显著抑制作用;LPS、TNFα引起的[Ca2+]i浓度升高与β-AR介导的信号转导通路无关;[Ca2+]i升高可能参与了G蛋白偶联受激酶的活性调节。
【关键词】 内皮细胞;游离钙;脂多糖;肿瘤坏死因子α
Abstract Objective To investigate the effects of lipopolysaccharide (LPS) and tumor necrosis factor α (TNF α) on intracellular free calcium ([Ca2+]i) of rat pulmonary microvascular endothelial cells (RPMVEC) and the relationship between [Ca2+]i. and beta adrenoceptor (βAR).Methods Equal amount of cells was incubated on glass films; experiment was carried out when the cell monolayer confluented; group pision in the experiment was as follows: LSP group (10μg/ml of LPS added)， LPS+anisodamine group (10μg/ml of LPS and 10μg/ml of anisodamine added)， TNFα group (5000μ/ml of TNFα added)， TNFα+anisodamine group (5000μ/ml of TNFα and 10μg/ml of anisodamine added) and normal control group (equal amount of diluent added)， and each group had 4 samples. [Ca2+]i. In each group was measured at the time point of 15 and 90 minute with the method from reagent kit instruction and literature.Result [Ca2+]i in LPS group and LPS+anisodamine group at the time point of 15 and 90 minutes were all significantly higher than that in normal control group (P&<0.01)， but there existed no significant difference of [Ca2+]i between LPS group and LPS+anisodamine group at the same time points (P&<0.01); [Ca2+]i in TNFα group and TNFα+anisodamine group at the time point of 15 and 90 minute were also significantly higher than that in normal control group (P&<0.01) but there was no significant difference of [Ca2+]i. between TNFα group and TNFα+anisodamine group at the time point of 15 and 90 minute.Conclusions Both LPS and TNFα can lead to the significant increase of [Ca2+]i in RPMVEC; the increase of [Ca2+]i is not related to the signal transduction pathway mediated by beta adrenoceptor while [Ca2+]i can participated in the regulation of G protein coupled receptor kinases.
KEYWORDS endothelial cell free calcium lipopolysaccharide tumor necrosis factor α
细胞内钙离子和cAMP作为细胞内第二信使，对于正确传导细胞内外的各种信息至关重要，是多种信号转导过程中的关键因子，在内皮细胞的损伤过程中也起着重要作用。细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)升高是多种因素引起血管内皮损伤必须的信号。我们既往的研究发现，脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子α(TNFα)作用后大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)不仅出现β肾上腺素能受体(β-AR)下调，并且出现F-肌动蛋白解聚和RPMVEC单层通透性增高[1-3]。那么LPS、TNFα这两种与急性肺损伤发生关系密切的因素作用后，RPMVEC [Ca2+]i将会发生什么样的变化?这种变化与β-AR下调有无关联本研究拟通过实验并结合我们既往的工作，对上述问题进行探讨。
1 材料与方法
1.1 RPMVEC的分离、培养和鉴定 按我们所改进的方法进行[4]。原代培养第1～2周，80%～90%细胞单层汇合时用0.5%胰蛋白酶消化后按1∶3传代。实验用2～5代细胞进行。
1.2 LPS和TNFα对RPMVEC [Ca2+]i的影响 根据试剂盒说明书和文献介绍的方法进行[5]。将细胞制成悬液接种于盖玻片上，细胞单层汇合后换含0.1%胎牛血清的DMEM培养基培养48 h，使其处于静止状态。实验分组：LPS组加10μg/mlLPS，LPS+山莨菪碱组加10μg/mlLPS+10μg/ml山莨菪碱，TNFα组加5000u/mlTNFα，TNFα+山莨菪碱组加5000u/mlTNFα+10μg/ml山莨菪碱(均用含0.1%FBS的DMEM培养基稀释)，正常对照组加等量稀释液(各组n=4)。作用15、90min后于含fura-2/AM(5μmol/L)的PSS液中37℃孵育1h。漂洗后在LS-50B型荧光分光光度计上用双波长比例测量法检测，激发波长为340nm和380nm，发射波长为500nm，根据公式[Ca2+]i(nmol/L)= Kd×[(R-Rmin)/(Rmax-R)]×β计算钙离子浓度。公式中Kd为fura-2对Ca2+的解离常数，37℃时为224nmol/L;R为各样本在340nm和380nm的荧光强度的比值;Rmin为最小荧光比值，由加入高于Ca2+浓度(2～3倍)的EDTA后测得;R max为最大荧光比值，由加入终浓度为0.1%的Triton-X100后测得;β为380nm时fura-2在零钙和饱和钙条件下的荧光强度比值。
1.3 统计学处理 所有数据均用SPSS软件处理，结果用均数±标准差表示，组间和组内差异比较选用t检验。
2 结 果
2.1 LPS作用后RPMVEC [Ca2+]i的变化 LPS作用后大鼠PMVEC[Ca2+]i 的变化见表1。LPS组与正常对照组比较，15min和90min两个时相点[Ca2+]i均显著升高(P&<0.01);LPS+山莨菪碱组与正常对照组比较，15min和90min两个时相点[Ca2+]i也显著升高(P&<0.01);LPS组与LPS+山莨菪碱组比较，15min和90min两个时相点[Ca2+]i无明显差异(P&>0.05)。表1 LPS对RPMVEC[Ca2+]i的影响*、**、Δ、ΔΔvs control，P&<0.01;*vsΔ，P&>0.05;ΔΔvs**，P&>0.05 (n=4)
2.2 TNFα作用后RPMVEC[Ca2+]i的变化 TNFα作用后RPMVEC[Ca2+]i 的变化见表2。TNFα组与正常对照组比较，15min和90min两个时相点[Ca2+]i均显著升高(P&<0.01);TNFα+山莨菪碱组与正常对照组比较，15min和90min两个时相点[Ca2+]i也显著升高(P&<0.01);TNFα组与TNFα+山莨菪碱组比较，15min和90min两个时相点[Ca2+]i无明显差异(P&>0.05)。表2 TNFα对RPMVEC[Ca2+]i的影响*、**、Δ、ΔΔvs control，P&<0.01;*vsΔ，P&>0.05;ΔΔvs ** ，P&>0.05 (n=4)
3 讨 论
影响细胞内游离钙浓度的因素主要有细胞外液的钙离子浓度和细胞内钙库。正常情况下，由于细胞膜上Ca2+-ATP酶的作用，细胞内游离钙能够保持较低浓度[6]。内皮细胞的许多功能活动与细胞内游离钙浓度变化有关，内皮细胞活化后产生和分泌的许多血管活性物质又具有钙离子敏感性和钙离子依赖性[7]，两者互为条件，互为因果。
LPS是革兰阴性菌细胞壁的结构成份，与脓毒症、急性肺损伤的发生密切相关。本实验发现，LPS作用后15min和90min两个时相点，RPMVEC [Ca2+]i均较正常对照组显著升高;加山莨菪碱干预后，LPS作用15min和90min两个时相点大鼠PMVEC [Ca2+]i也较正常对照组显著升高。这表明LPS作用可使大鼠PMVEC [Ca2+]i显著升高，山莨菪碱对LPS诱导的大鼠PMVEC [Ca2+]i升高无显著抑制作用。LPS引起血管内皮细胞[Ca2+]i升高的信号转导途径尚不完全清楚。蛋白酪氨酸磷酸化可能在调节LPS引起血管内皮细胞损伤的信号转导机制中起重要作用。通过观察[Ca2+]i的变化，可以了解LPS作用信号在靶细胞内的转导机制。有研究发现，LPS刺激可在2～5min内使细胞内[Ca2+]i迅速升高，而且在一定范围内其上升幅度与LPS剂量相关[8]。细胞外Ca2+存在与否对LPS刺激后胞内[Ca2+]i波动有明显影响，提示[Ca2+]i的升高主要来源于细胞外Ca2+的内流而非细胞内钙库的动员[8]。我们既往发现，LPS作用后RPMVEC出现β-AR下调、F-肌动蛋白解聚和单层细胞通透性增高[1，2]，提出β-AR下调可能是LPS引起RPMVEC F-肌动蛋白解聚和单层通透性是增高的原因之一;并且推测LPS引起RPMVECβ-AR下调，经β-AR传入细胞内的信号减弱，结果可能会使细胞内[Ca2+]i下降。但本实验结果提示，LPS作用后大鼠PMVEC[Ca2+]i升高，表明LPS引起的RPMVEC[Ca2+]i升高可能与β-AR介导的信号转导通路无关。我们不仅观察到LPS引起的RPMVEC[Ca2+]i升高，在另外的实验中还观察到LPS作用后RPMVEC G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)表达也是增高的[9]。有研究发现钙离子参与GRKs的活性调节，如钙结合蛋白recoverin可抑制视紫质激酶活性[10]，与我们的实验结果一致。
TNFα是一种炎性细胞因子，体内TNFα的主要来源是活化的巨噬细胞。本实验结发现，TNFα作用15min和90min，RPMVEC [Ca2+]i浓度均显著升高，与文献报道结果一致[11]。有报道TNFα作用后不仅引起的血管内皮细胞内游离钙浓度升高，而且细胞内游离钙浓度升高的幅度与TNFα的作用呈浓度依赖性，即TNFα的作用浓度越高，引起的细胞内游离钙浓度升高的幅度也越大[11]。我们既往发现，TNFα作用后出现的β-AR下调是引起RPMVEC F-肌动蛋白解聚和单层细胞通透性增高的重要原因[3]，β-AR介导的信号转导通路在该过程中扮演着重要角色，推测TNFα在引起RPMVECβ-AR下调的同时必然会引起细胞内第二信使钙离子浓度的下降。但本实验结果提示，TNFα作用15min和90min，[Ca2+]i浓度均显著升高，表明TNFα引起的[Ca2+]i浓度升高可能与β-AR介导的信号转导通路无关。
综上所述，LPS、TNFα作用可使SPMVEC [Ca2+]i显著升高，山莨菪碱对LPS、TNFα诱导的RPMVEC [Ca2+]i升高无显著抑制作用;LPS、TNFα引起的[Ca2+]i浓度升高可能与β-AR介导的信号转导通路无关;[Ca2+]i升高可能参与了G蛋白偶受体激酶的活性调节。
参考文献
[1] 肖贞良，孙耕耘，钱桂生，等.TNF-α对大鼠肺微血管内皮细胞β-受体及其相关GRKs的影响[J].第三军医大学学报，2004，26(10)：859-862.
[2] 肖贞良，孙耕耘，钱桂生.脂多糖致肺微血管内皮细胞单层通透性损伤的实验研究[J].中华结核和呼吸杂志，1999，22(7):427.
[3] 肖贞良，孙耕耘，夏前明，等.肿瘤坏死因子致肺微血管内皮细胞单层通透性损伤的实验研究[J].中国应用生理学杂志，2001，17(1):79-81.
[4] 肖贞良，孙耕耘，钱桂生.肺循环灌注对大鼠肺微血管内皮细胞分离和培养的影响[J].中国病理生理杂志，1999，15(11):1053-1054.
[5] Ye QL，Wart D.Thyrotrophin，but not Forskolin，increases intracellular free calcium and calmodulin in p ig thyroid cells[J ].J Endocrinol，1991，129:291-296.
[6] Carafoli E.Ca2+-ATPase and calcium regulation[J].FASEB J，1994，8:993-1002.
[7] Campbell DL，Strauss HC，Worton AR，et al.Voltage dependence of bovine pulmonary endothelial cell function[J].J Mol Cardiol，1991，23:133-140.
[8] 闻 平，戴赓孙，叶庆林.细菌脂多糖对NIH3T3细胞增生、胞内游离钙及cAMP浓度的影响[J].医学研究生学报，2000，13(5):295-297.
[9] 肖贞良，钱桂生，孙耕耘，等.脂多糖对肺微血管内皮细胞β-受体及β-受体激酶影响的研究[J].解放军医学杂志，2003，28(2):119-121.
[10]Chen CK，Inglese J，Lefkowitz RJ，et al.Ca(2+)-dependent interaction of recoverin with rhodopsin kinase[J].J Biol Chem，1995，270(30):18060-18066.
[11]金 镇，裴 凌，王德智.肿瘤坏死因子对脐静脉内皮细胞增殖和细胞内游离钙的影响[J].中华妇产科杂志，2000，35(11):657-659.