【摘要】 目的 探讨中性粒细胞碱性磷酸酶染色的实验条件。方法 用40%、60%、80%的丙酮-枸缘酸固定液对中性粒细胞碱性磷酸酶染色固定条件进行测定。同时用2-氨基-2-甲基-1.3-丙二醇(pH9.4-9.6)缓冲液、巴比妥(pH9.2)缓冲液、Tris(pH9.2)缓冲液配制的基质液分别在10、15、20分钟的染色条件进行测定。结果 是选择60%的丙酮-枸缘酸固定30秒染色结果最好。三种不同的缓冲液和三个不同的孵育时间的染色结果经多因素方差分析，P&<0.05，结果有统计学意义。结论 最佳染色条件为60%的丙酮-枸缘酸固定30秒，用Tris(pH9.2)缓冲液配制的基质液，孵育时间为15分钟。本方法帮助鉴别慢性粒细胞性白血病和类白血病有较大的实用价值。
【关键词】 中性粒细胞;碱性磷酸酶;白血病;类白血病
ABSTRACT Objective To discuss the experimental conditions of neutrophil alkaline phosphatase staining. Methods The immobilizing conditions of neutrophil alkaline phosphatase staining were detected by the stationary liquid of 40%， 60% and 80% acetone-citric acid， and at the same time， the staining conditions were detected at 10， 15 and 20 minutes in the matrix liquid prepared respectively with 2-amino-2-methyl-1.3-propylene glycol (PH9.4-9.6) buffer， barbital (PH9.2) buffer and Tris (PH9.2) buffer. Results Fixing in 60% acetone-citric acid for 30 seconds gave out the best staining results; the staining results of the three different buffers and the three different incubating times received the multiple factor variance analysis， the differences among them was of statistical significance (P&<0.05). Conclusions The best staining conditions include fixing in 60% acetone-citric acid for 30 seconds， the matrix liquid prepared with Tris (PH9.2) buffer and incubation for 15 minutes; this method is of practical value in helping identify chronic myeloid leukemia and leukemoid reaction.
KEYWORDS neutrophil alkaline phosphatase leukemia leukemoid reaction
中性粒细胞碱性磷酸酶主要存在于中性成熟粒细胞，在pH9.6左右的碱性环境中，能水解基质液中的磷酸奈酚钠底物，释放出奈酚，后者与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质酶活性所在之处。由于不同的疾病，以及疾病的不同阶段均可引起碱性磷酸酶成分及含量的变化，故临床上常常用于白血病的分类，辅助血液系统等疾病的诊断与鉴别诊断、观察疾病疗效与预后以及对发病机制的探讨[1-2]。多年来，由于各实验室所用的固定液浓度和固定时间不统一，所用缓冲液及孵育时间不同，因此参考值变化较大，各实验室之间结果差异较大[3]。本文意在寻找一个最佳的实验条件，减少实验误差，更好为临床提供有用的数据。
1 材料与方法
1.1 取材 取20例正常人指间血涂片。白细胞分类计数结果，中性粒细胞50%～70%，淋巴细胞20%～30%，单核细胞2%～4%。细胞形态规则，结构完整。
1.2 试剂 (1)丙酮-枸缘酸固定液(pH4.2～4.5)： 枸缘酸缓冲液和纯丙酮分别按3：2、2：3、1：4比例配制成40%、60%及80%的固定液。(2)缓冲液：① 2-氨基-2-甲基-1.3丙二醇缓冲液(pH9.4-9.6)：0.2MOL/L2-氨基-2甲基-1.3丙二醇液25ml+0.1N盐酸5.0ml+Dh3O至100ml。② 巴比妥缓冲液(pH9.2)：0.1MOL/L巴比妥钠液9.85ml+0.1N盐酸0.15ml+Dh3O至100ml。③ Tris缓冲液(pH9.2)：0.2MOL/Ltris液25.0ml+0.1N盐酸5.0ml+Dh3O至100ml。(3)基质液 奈酚AS-BI磷酸盐5mg+固紫B盐40mg+缓冲液60ml混匀，过滤后使用，新鲜配制。(4)苏木素复染液。
1.3 操作方法
1.3.1 固定条件的操作方法 标本20例，每例涂片6张，分3组，每组2张，将3组血片分别用40%、60%、80%的丙酮-枸缘酸固定液固定。在30、60秒时从三种固定液中各取出一涂片，水洗，晾干后染色。计算中性粒细胞的平均阳性率和积分值。
1.3.2 不同缓冲液及孵育时间的操作方法 据上述二因素三水平，选择L9(32)正交表作正交试验。取标本20例，每例涂片9张，分3组，每组3张，用60%的丙酮-枸缘酸固定液固定。分别放入已预热至37℃的用2-氨基-2-甲基-1.3-丙二醇(pH9.4～9.6)缓冲液、巴比妥(pH9.2)缓冲液、Tris(pH9.2)缓冲液配制的基质液中，分别于10、15、20分钟时，从不同的基质液中各取出一张血涂片，冲洗，晾干，复染，镜检，计数不同水平的阳性率均数。
1.3.3 正常参考值调查 取血常规检验正常的标本30例，用经试验确定了的最佳实验条件染色，确定中性粒细胞碱性磷酸酶的阳性率和积分水平。
2 结果与讨论
2.1 固定条件对染色结果的影响 实验证明：40%的丙酮-枸缘酸固定液，由于丙酮浓度过低，不能使蛋白质完全凝固，固定后的血片，经水冲洗后，涂片细胞所剩无几，不易寻找。而80%的丙酮-枸缘酸固定液，由于丙酮浓度过高，立即使细胞脱水，蛋白质凝固，细胞变形，不易辨认，背景模糊。60%的丙酮-枸缘酸固定液固定效果较好。不同固定时间的结果，见表1。表1 60%的丙酮-枸缘酸固定液不同时间碱性磷酸酶染色结果比较随着固定时间的延长，中性粒细胞碱性磷酸酶染色的阳性率和平均积分值均明显减低，积分结果经显著性检验，P&<0.01，有显著性差异。故选择60%的丙酮-枸缘酸固定液固定30秒，可以缩短固定时间，染色结果最好。
2.2 不同的缓冲液及孵育时间对染色结果的影响 正交试验的结果表明，在缓冲液因素中，用Tris(pH9.2)缓冲液配制的基质液，中性粒细胞碱性磷酸酶阳性率和积分的均值最高，故选择此缓冲液作为基质的缓冲液。在时间因素中，则以15、20分钟孵育的阳性率和积分的均数值最高，15、20分钟与10分钟进行比较，经方差分析R=39.F2=5.14，P&<0.05，差异有统计学意义。而15分钟和20分钟比较结果无差异。故选择15分钟作为孵育时间，一则可以缩短孵育时间，更重要的是此时间孵育的阳性棕红色沉淀定位好，不弥散，染色背景清晰，细胞形态、结构清楚。正交试验结果还表明，时间因素的极差值大于缓冲液因素的极差值。说明孵育时间比缓冲液的影响更大，见表2、3。表2 不同浓度的缓冲基质液及孵育时间的碱性磷酸酶染色结果比较表3 不同的缓冲液和孵育时间的碱性磷酸酶染色结果的均值注：F1为不同的缓冲基质液间比较，F2为不同孵育时间的比较，1、2、3分别代表不同水平试验结果的均值，R为积差
2.3 30例血常规检验正常的标本染色结果 见表4。经D检验，中性粒细胞的阳性率和积分值的D值为0.2835和0.2833，均属于正态分布(2725 表4 中性粒细胞碱性磷酸酶染色参考值结果笔者对中性粒细胞碱性磷酸酶染色的多个实验条件进行了探讨。发现固定的方法及时间，配制基质液的缓冲液和孵育时间对染色结果都有影响。从中选出了最佳染色条件为60%的丙酮-枸缘酸固定液固定30秒，用Tris(pH9.2)缓冲液配制的基质液，孵育15分钟，在此条件下测得的值对提高临床的染色效果，帮助鉴别诊断白血病有较大的实用价值。
参考文献
[1] 于增国，王霄霞，冯文莉，等.临床血液学和血液检验[M].第3版.北京：人民卫生出版社，2004：56.
[2] 王鸿利.血液学及血液学检验[M].第2版.北京:人民卫生出版社，1988：45.
[3] 常玉荣，石 峻.血细胞形态学观察对血液系统疾病诊断的意义[J].检验医学杂志，2007，(1)：78.
[4] 王志萍，万江涛.两种方法采血对白细胞、血小板计数结果的影响探讨[J].中国医学检验杂志，2006(04)：270.