【摘要】 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)放疗后复发是导致治疗失败的主要原因。放射治疗诱发的瘤细胞DNA损伤修复能力及细胞凋亡调控的不同直接影响瘤细胞对放疗的敏感性。近几年提出的肿瘤干细胞(TSC)理论认为，肿瘤复发、转移以及对治疗的耐受等均与TSC相关。本文将从放疗所致的DNA损伤修复，瘤细胞凋亡和肿瘤干细胞三个方面来对NPC鼻咽癌放疗后复发机制作一综述。
【关键词】 鼻咽癌;放射治疗;肿瘤干细胞
鼻咽癌是我国南方地区常见恶性肿瘤之一，以放射治疗为主，但疗效尚不理想，约55%的NPC在放疗后5年出现复发转移。其原因主要与NPC发病部位隐蔽、鼻咽部组织构成复杂，治疗方式较单一，且不同的NPC患者在病理类型、肿瘤分化程度、就诊时病变严重程度、临床表现、体质状况、对放化疗敏感性方面都存在着不同程度的差异有关。本文对影响NPC放疗敏感性的机制综述如下。
1 DNA损伤修复与NPC放疗后复发
1.1 DNA修复基因 放射可引起DNA链断裂和DNA-蛋白交联，最终导致细胞死亡。DNA的修复能力是影响细胞存活和死亡的原因之一。
hMSh3是被研究最多的错配修复系统基因之一。hMSh3蛋白参与组成hMutSα和hMutSβ二聚体，识别DNA复制中的错配碱基及插入缺失环，并与之结合，是完成DNA修复必需的组件之一[1，2]。范凯[3]等报道放射可以诱导鼻咽癌细胞hMSh3表达;hMSh3对放射造成的DNA损伤可能有修复作用。
MGMT基因主要修复由烷化剂等诱变剂造成的DNA损伤。DNA链的断裂是诱导MGMT表达的最终信号，电离和紫外线辐射可以诱导MGMT的表达。人类和鼠肝细胞以及肺、肾等组织在接受电离辐射后MGMT表达及酶活性增强，MGMT的这种改变发生在基因转录水平，并且与其启动子的激活有关。刘敏等[4]认为X射线照射可能诱导CNE细胞株MGMT基因的表达，参与细胞照射后DNA损伤修复过程。
DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)是哺乳动物细胞经照射后，参与DNA双链断裂(DSB)损伤修复主要的分子途径之一，是由Ku70、Ku80以及DNA-PKcs(DNA-PK的催化亚基)三亚基组成，其中Ku70、Ku80组成Ku蛋白调节亚基，在DSB修复中起着辨认、结合和排列DNA末端并招募催化亚基DNA-PKcs的作用。曲颂等[5]认为DNA-PKcs是决定鼻咽癌DNA-PK功能比较重要的亚基，其催化功能在射线照射后引起的DSB修复中发挥着较为重要的作用，调控着DNA-PK的活性，DNA-PKcs基因的表达与鼻咽癌细胞的放射敏感性有关。另有研究表明[6，7]，不同放射敏感性的细胞株CNE1(敏感性低)、CNE2(敏感性高)中Ku70、Ku80、DNA-PKcs的表达水平无明显差异，而在射线照射后三者的表达水平却明显升高，这表明Ku70、Ku80、DNA-PKcs在鼻咽癌的放射敏感性中起着重要的作用。
1.2 热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs) HSPs是一组具有重要生理功能的糖蛋白质，在体内可与多种蛋白形成复合体，参与蛋白质的折叠与伸展、多聚复合体的组装，发挥调节靶蛋白的作用，但又不改变靶蛋白的结构，又称为“分子伴侣”。根据其同源程度及分子量大小分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP等几个家族。HSP90、1HSP70在许多肿瘤中有表达。在放射适应性反应中，由蛋白质组成的DNA修复系统起着主要作用。近年研究发现HSPA8 heat shock 70kDa protein 8)与放射适应性反应关系密切。冯雪萍等[8]报道HSP90β和HSPA8 参与了细胞照射后DNA修复系统的构建，与放射耐受有一定的相关性，并推测HSPs可能与CNE1细胞株放射相对耐受有关。
gp96是存在于真核生物细胞内质网中的分子量约为96kD的热休克蛋白，属于HSP90家族。有研究表明[9]，基于gp96的免疫治疗可以提高放射治疗的功效。Chang等[10]实验发现用RNA干扰鼻咽癌放射抵抗细胞gp96基因的表达，能够使瘤细胞克隆形成能力减弱。据报道[11，12]，HSP90调节Akt激酶活性并且参与放射后DNA损伤修复。gp96作为HSP90家族成员之一，是否也通过影响Akt来发挥细胞保护作用和增强细胞生存能力，其机制还有待于进一步研究。
2 瘤细胞凋亡调节与NPC放疗后复发
2.1 p53基因 p53是一种凋亡抑制基因，在细胞周期的调控和诱导细胞凋亡中起重要作用。其编码蛋白可分为野生型蛋白(wtp53)和突变型蛋白(mtp53)。wtp53是体内重要的抑癌基因，它通过调节细胞周期和诱导细胞凋亡而发挥其抑癌的功能。当细胞发生DNA损伤时，wtp53蛋白的表达会急剧升高，导致细胞周期停滞在G1期来进行修复，使细胞恢复正常状态，重新进入细胞周期。若损伤无法修复，它可激活与DNA凋亡相关基因如bcl-1/bax、TNF-α、Fas等，启动细胞凋亡机制，使有癌变倾向的细胞失去活性从而起到抑癌的作用。多数学者认为由于mtp53干扰DNA受损细胞的G1期抑制，使其很快进入S期，另外增加了DNA修复酶的活性、提高DNA修复能力，因而抗拒放射线。
在NPC中，60%以上的NPC组织和几乎100%的NPC细胞株有p53蛋白过表达。p53蛋白过表达及其功能失活可能与一些EB病毒基因产物与wtp53蛋白稳定结合，使p53蛋白半衰期延长有关。叶伟军等[13]研究发现NPC中p53表达高者放射敏感性差。而石慧英等[14]研究结果表明NPC细胞中过表达的p53蛋白具有生物学功能，在放射诱导的NPC细胞损伤和凋亡中发挥重要作用，临床NPC病人对放疗抗拒可能与p53蛋白过表达无关。Agaoglu等[15]对97例NPC患者行免疫组织化学p53检测，发现p53表达与分期、总生存率、无病生存率无关。
2.2 bcl2基因 bcl2基因是目前发现的抗凋亡作用最强的基因之一，它通过抑制细胞凋亡而延长细胞存活。一般认为bcl2蛋白可能是作为抗氧化剂起作用，通过调整Ca2+转运而调节凋亡。大量研究表明，bcl-2蛋白的高表达会抑制放疗诱导的肿瘤细胞凋亡，而抑制bcl-2基因的表达可能会增加放射敏感性。Jayasurya[16]等认为bcl-2高表达与NPC放疗后局部复发存在相关性。Yu等[17]研究表明Bcl-2蛋白的高表达可以阻止放疗引起的细胞凋亡，降低鼻咽癌细胞对放疗的敏感性。张文玲等[18]利用免疫组化、原位杂交检测发现，Bcl-2在NPC放疗敏感组和放疗不敏感组比较有统计学差异，提示bcl-2参与了NPC的放疗耐受。而苏珊[19]等认为bcl-2可能未参与放射引起的NPC细胞株CNE-1及CNE-2的凋亡过程。
2.3 MDR1基因多态性，STR基因多态性 P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是由多药耐药基因(MDR1)编码的一种转运蛋白。P-gp可以稳定肿瘤细胞线粒体膜电位和线粒体膜通透性，抑制X射线的凋亡效应，从而递呈放射抵抗表型。迄今已发现MDR1基因有多个单核苷酸多态性，其中有21外显子G2677T(Ala893Ser)和26外显子C3435T(Ile1145Ile)及其单体型，可能与MDR1和P-gp的功能和表达密切相关。王等[20]发现MDR1G2677T和C3435T多态性可能是NPC放疗疗效的影响因素之一。
STR基因座由长度为1～6个碱基对的短串联重复序列组成[21]。这些重复序列广泛分布于人类基因组中并呈现高度多态性。串联重复序列可能影响染色质结构、基因活性的调控、DNA复制重组、细胞分裂周期及错配修复系统等。王旭丹等[22]研究表明，不同辐射抗拒鼻咽癌细胞株CNE-2和CNE-2R细胞的STR基因座表达存在量和质的差异，变异的STR基因座可能参与鼻咽癌细胞CNE-2辐射抗拒的诱导。至于这些串联重复序列如何影响NPC细胞辐射抗拒的确切机制有待进一步探讨。
2.4 放疗群集耐受性(multicellular resistance) 研究表明，实体瘤的放疗敏感性与单层培养的肿瘤细胞显著不同;在三维培养时，肿瘤细胞对细胞毒药物和放射线等治疗的耐受性比单层细胞明显增强，而与在体肿瘤相近，即群集耐受性。
整合素是重要的细胞黏附分子，介导细胞与细胞以及细胞与细胞外基质的黏附作用。αV整合素是肿瘤细胞形成三维结构的重要分子，抑制αV整合素的作用影响多细胞球(MCSs)的形成过程。栾巍等[23]研究表明，NPC中，较之单层细胞，MCSs的放射敏感性显著下降;2Gy的X射线照射后MCSs凋亡率上调亦不明显，体现了MCSs的群集耐受性。肿瘤多细胞球广泛而紧密的黏附是群集耐受的基础。实验中用单克隆抗体预先阻断αV整合素的作用后再照射，则MCSs的细胞存活率下降，放射敏感性提高，凋亡率也明显上调。栾巍等[24]用CNE-2Z多细胞球模拟实体瘤实验表明，SAPK/JNK信号通路短暂激活可能传递生存信号而在鼻咽癌放疗群集耐受中发挥作用，特异性阻断其信号传递上调MCSs凋亡率，这可能与促进caspase3蛋白表达有关。
3 肿瘤干细胞与NPC放疗后复发
TSC是一类具有永生或无限自我更新能力的细胞，它们的数目相对恒定，有强的迁徙、浸润和转移能力;具有多分化潜能，能分化为不同表型的肿瘤细胞;在发育期间能够通过对称性分裂以扩增数量，或者通过非对称性分裂进行自我更新和产生更多不同分化类型的祖细胞;这些细胞具有治疗抵抗特性，能够耐受传统的细胞毒化疗和放射治疗。许多学者认为，肿瘤复发、转移以及对治疗的耐受等均与TSC相关。
2007年，Wang等[25]从5个鼻咽癌细胞系CNE-1，CNE-2，SUNE-1，HONE-1，和C-666-1中分离出了具有干细胞表型特征的肿瘤细胞(SP细胞)，并且检测了从CNE-2细胞系中分离出的SP细胞的干细胞特性，结果表明SP细胞具有强的分裂增值能力、自我更新能力及分化潜能，并且具有对放疗和化疗的抵抗性。通过将SP细胞植入非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)体内，他们观察到SP细胞具有很强的成瘤能力。Wang等还发现SP细胞高表达角蛋白19，这很可能成为进一步研究鼻咽癌肿瘤干细胞的有用的分子标志。
肿瘤干细胞放射抗拒的机制可能与损伤DNA的修复，影响细胞周期调控、细胞凋亡、增殖等信号转导通路改变有关。Bao等[26]通过多种放射损伤标记例如DNA损伤修复、肿瘤细胞凋亡、γh3AX焦点形成等检测放射线处理后的变化，从而验证CD133+肿瘤干细胞表现出显著的放射抗拒。并且他们还发现胶质瘤干细胞在接受放射线处理后，有效激活了放射引起的DNA损伤信号通路，使得相关通路蛋白—ATM，Rad17，Chk1和Chk2磷酸化，通过给予检查点(Chk1和Chk2)激酶的特异性抑制剂能够逆转肿瘤干细胞放射抗拒。他们推断胶质瘤干细胞能够通过优先激活DNA损伤的应答，诱导细胞循环阻滞进而修复损伤的DNA，从而提高放射抗拒。神经肿瘤干细胞与正常神经干细胞有相类似的信号转导途径，如Wnt途径、Notch途径、Shh途径等[27]。这些信号转导途径在一些其他肿瘤干细胞中可以调节其放射敏感性。Chen等[28]在乳腺癌细胞中验证Wnt/β-catenin信号转导通路能够调节乳腺癌干细胞放射敏感性。Phillips等[29]研究了电离辐射是否直接干扰Notch-1信号通路，发现分次放射线处理激活Notch-1信号通路，将会引起乳腺癌干细胞的增加，引起放疗抗拒。Wang等[25]发现Shh信号转导通路能够调节鼻咽癌干细胞样细胞放射敏感性，经环王巴明(Cyclopamien)处理封闭该信号转导通路能够提高鼻咽癌干细胞样细胞放射敏感性。此外，肿瘤干细胞的放射敏感性除与其内在敏感性密切相关以外，其活体微环境也很可能正向或者负向调节其特性。
4 结 语
NPC放疗后复发涉及了多个基因的共同参与，它们之间的相互作用是NPC放疗后复发的基础。NPC放疗后复发的机制仍不清楚。随着基因组学和蛋白质组学方法的不断完善，建立恶性肿瘤发生和发展过程中基因表达谱和蛋白质表达谱，将使筛选出NPC放疗后复的相关分子成为可能。
NPC肿瘤干细胞研究对于探索NPC的发病机制、复发转移机制、判断预后以及探索新的治疗方法具有重要意义。针对肿瘤干细胞的治疗有望从根本上治疗肿瘤。通过调控肿瘤干细胞内重要基因表达而使其失去干细胞特性，研究肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞蛋白或基因表达的差异、信号转导通路的差异、表面标志的差异，选择性地对这些细胞进行干预，可为NPC的治疗开辟新的途径。NPC肿瘤干细胞研究还处于起步阶段，这些细胞数量少，且其信号转导通路及表面标志与正常成体干细胞有较多的共性，缺乏特异标志进行区分。这些都为选择性杀灭肿瘤干细胞提出难题。这些细胞保持长期自我更新的机制、对称分裂及非对称分裂方式的调控机制均有待进一步研究。
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