巯基受损对内皮细胞NO系统的影响

【摘要】 　　目的 通过检测巯基螯合剂DEM对内皮细胞二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)活性的影响，探讨马来酸二乙酯(DEM)对内皮细胞NO通路功能障碍的影响。方法 找出处理内皮细胞时DEM作为巯基螯合剂的最适剂量和时间。以最适DEM剂量和时间预处理内皮细胞后，继续培养24小时，检测各时间段的DDAH活性及NO含量。结果 DEM最适剂量为0.6umol/L，最适作用时间为30分钟。经DEM预处理后DDAH活性随之降低，至2小时时达最低值，以后DDAH活性逐渐恢复； NO含量在DEM预处理后显示相似的改变。结论 DEM可导致内皮细胞NO通路功能障碍。提示DDAH活性降低可能与DDAH的巯基受损有关，进一步提示保护DDAH的巯基是对抗各种NO通路功能障碍因素的重要途径之一。

【关键词】 谷胱甘肽(GSH) 二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH） 一氧化氮(NO) 氧化应激

　　Abstract Objective To investigate the effect of DEM on the function of NO pathway in endothelial cells by detecting the impact of DEM on the activity of DDAH in endothelial cells. Methods The most suitable dosage and the best time of DEM as sulfhydryl chelating agent when treating endothelial cells were searched out， after protreated with the right dosage at right time， the endothelial cells were kept cultured for 24 hours; the activity of DDAH and the content of NO at each time intervals were detected respectively.Results The most suitable dosage of DEM was 0.6umol/L while the best time was 30 minutes; after the pro-treatment of DEM， the activity of DDAH decreased and reached the lowest level in 2 hours， and then the activity of DDAH gradually mounted up; similar changes were found in the content of NO after the protreatment of DEM.Conclusions DEM may lead to the dysfunction of NO pathway in endothelial cells; it is indicated that the activity decrease of DDAH may be related with the sulfhydryl damage of DDAH and it is further indicated that to protect the sulfhydryl of DDAH is one of the most important confrontations to various factors of dysfunction of NO pathway.

　　Keywords glutathione (GSH)　　 dimethylarginine dimethylaminohydrolase (DDAH)　　 Nitric oxide (NO)　　 oxydative stress

　　内皮细胞分泌的一氧化氮(NO)是调控心血管功能的最重要因子之一，NO通路的功能障碍参与了动脉粥样硬化的发生发展。氧化应激被认为是引起内皮NO系统功能障碍的重要原因。研究证实， NO合酶抑制物不对称二甲基精氨酸(ADMA的增多可能是造成NO通路功能障碍的重要机制之一。而ADMA在体内的增多主要与其分解代谢酶二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）的功能障碍密切相关［1，2］。DDAH活性中心的半胱氨酸残基(SH)被认为是各种因素素作用于DDAH活性的靶点。为探讨此种可能性，我们以巯基耗竭剂马来酸二乙酯(DEM)作用于内皮细胞， 因为已有实验证实，DEM可以通过与GSH发生鳌合迅速而短暂地消耗细胞内的GSH［3］，但DEM是否可对DDAH产生相似的影响尚未见报道。

　　１ 材料和方法

　　1.1 药品和试剂 小牛血清、RPMI1640培养基、DEM、二乙酰一肟、安替比林、三氯醋酸、邻苯二醛、N乙基马来酰亚胺。

　　1.2 细胞株 内皮细胞株ECV304由四川大学免疫教研室提供。

　　1.3 仪器 CO2培养箱（德国Heraeus公司）；荧光分光光度计（日本岛津公司）；550型酶标仪（Biorad公司）；不对称二甲基精氨酸ADMA购自Sigma公司；NO试剂盒，南京建成生物工程研究所。

　　1.4 ECV304细胞的培养 本实验采用人脐带静脉内皮细胞株(ECV304细胞)。细胞生长于完全M199培养基(含10％胎牛血清，20mmol/L Hepes、100U／ml的青霉素和100Ug／ml的链霉素)，培养条件为37℃，5％CＯ2，饱和湿度。细胞传代时以0．25％的胰酶消化，稀释成1×１06／ml的细胞悬液接种。

　　1.5 细胞生长抑制试验 以不同浓度DEM作用于内皮细胞不同时间段，以MTT法检测不同DEM浓度作用下的ECV304细胞的存活率。将细胞消化后，接种于96孔板每孔200ul。将培养板放入CO2孵箱中培养24或48小时换无血清培养基再继续培养24到48小时以使细胞同步化，加药。DEM用前先用乙醇溶解，然后用培养基倍比稀释成不同的浓度，每个浓度梯度8个孔，作用30分钟洗去所加药，加无血清培养基再孵育24小时后，做MTT检测。实验结果以细胞存活率表示，即：细胞存活率（%）=实验组吸光度/对照组吸光度×100%。

　　1.6 细胞内GSH含量的测定 取对数生长期的细胞，胰酶消化成细胞悬液，台盼蓝计数活细胞，并按5×105浓度接种于25cm2培养瓶，实验组按照6个不同的检测点分成6大组，分别为0、0.5、2、6、12、24小时组。分别设对照组与加药组。加药组在0.6μmol/L的马来酸二乙酯（DEM）预处理30分钟后去除DEM，换成无血清培养基继续培养0、0.5、2、6、12、24小时后收集细胞，对照组无DEM处理的步骤。在各时间点将细胞破碎(超声破碎细胞)取上清用于GSH的检测，取0.2ml细胞上清液用1.8ml的磷酸钠EDTA缓冲液稀释，再从稀释液中取出0.1ml加1.9ml缓冲液，混匀加入0.1mlOPT甲醇溶液，混匀室温静置30分钟待测。根据标准曲线计算GSH值。

　　1.7 DDAH活性的检测 细胞分组，各组细胞消化成单细胞悬液后调节细胞数为每样本1x106，完全裂解细胞，将细胞裂解液离心1500转/分，40分钟。上清液用于DDAH活性的检测［2］。上清液用4mmol/L的ADMA和0.1 mol/L的磷酸缓冲液(PH6.5)共0.5ml共同于37℃孵育2小时，然后加入同等体积的10%的三氯醋酸终止反应，上清液加0.8%［wt/vol］二乙酰一肟0.2ml(溶于5%醋酸)和0.5%［wt/vol］安替比林0.2ml(溶于50%硫酸)，60℃共煮110分钟，生成的L瓜氨酸的量用分光光度计在466nm下检测。空白对照组的上清液进行上述同样的处理（只是没有ADMA）。两组L瓜氨酸含量的差值反映DDAH的活性。正常对照组DDAH的活性定为100%，其他各组DDAH活性以与正常对照组的百分比来表示。

　　1.8 培养基中一氧化氮含量的检测 一氧化氮含量的检测用一氧化氮试剂盒检测。

　　1.9 统计学方法 所得实验结果以均数±标准差来表示。组间数据间差异的显著性采用t检验，多个样本均数比较采用ANOVA，统计分析应用SPSS软件包，P&<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 最佳DEM作用浓度和时间的确定 ECV304生存率对DEM的浓度和作用时间具有依赖性，随着DEM浓度和时间的增加，ECV304细胞的生存率逐渐下降(P&<0.05 )。选择0.6μmol/L DEM、30分钟作用时间，作为后续实验的DEM用量和作用时间。此时内皮细胞生存率比对照组略为下降，但影响不大。但在后续实验已能对GSH和DDAH显示出明显的影响。见图１。
　　
　　图1 DEM处理后ECV304细胞的存活率（略）

　　2.2 GSH含量的变化 ECV304细胞经0.6μmol/L DEM预处理30分钟后，洗去DEM，继续将ECV304细胞孵育不同时间段后测其相应的细胞内GSH含量。结果显示，GSH含量自DEM处理后迅速下降，半小时的GSH含量已较对照组明显降低(降低28.7%，P&<0.05 compared with control )，但随后逐步回升，12小时反超，明显高于正常水平(Ｐ&<0.01 compared with control )，随后又回落，24小时后基本恢复至正常水平（见图2，n=8）。

　　图2 DEM处理后ECV304细胞中GSH含量变化（略）

　　2.3 内皮细胞DDAH活性的改变 ECV304细胞经0.6μmol/L DEM预处理30分钟后，洗去DEM，继续将ECV304细胞孵育不同时间段后其相应的细胞内DDAH活性。结果显示，2小时后DDAH活性显著降低(降低80.07%，Ｐ&<0.05compare with control)，以后DDAH活性逐渐恢复，24小时后亦出现反超，呈现类似于GSH改变的趋势，但时间略滞后。
　　
　　图3 DEM处理后ECV304细胞中DDAH活性变化（略）

　　2.4 培养液中NO含量的改变 ECV304细胞经0.6μmol/L DEM预处理30分钟后，洗去DEM，继续将ECV304细胞孵育不同时间段后其上清液中NO的含量。结果显示，DEM预处理使ECV304细胞培养液中NO含量持续下降，2小时时降至最低水平(降低20.24%，P&<0.01 )，以后逐渐恢复，至24小时时恢复至接近正常水平，但未出现反超，变化趋势与DDAH基本相似。
　　
　　图4 DEM处理后ECV304细胞中NO活性量的相关分析（略）

　　2.5 DDAH活性与培养液中NO含量的相关性分析
　　
　　图5 DDAH活性与培养液中NO含量的相关性分析（略）

　　3 讨论
　　
　　NO系统的功能障碍导致的内皮功能障碍是动脉粥样硬化(AS)形成早期的始动环节［1，4］。内源性NO合酶抑制物不对称二甲基精氨酸(ADMA)的增多被认为是造成NO通路功能障碍的重要机制之一，ADMA的降解酶DDAH活性下降是ADMA增多的主要机制之一。DDAH的活性中心含有一个反应性的半胱氨酸残基(reactive cysteine residue Cys249) ［2］，而自由巯基易被损伤，常成为各种危险因素攻击靶标，因此DDAH的Cys249损伤理所当然地被认为是造成NO系统功能障碍的重要机制。但NO系统功能障碍的机制是否确与DDAH巯基的损伤有关？目前仍未证实。为此，我们在实验中以巯基螯合剂DEM、而不是氧自由基处理内皮细胞，以期确定耗竭巯基是否
确能损伤DDAH的活性，并进而降低NO的生成，引起NO系统的功能异常。
　　
　　DEM是一种巯基螯合剂，可与含巯基的GSH形成共价络合物，从而引起细胞内GSH水平的降低；且DEM较易渗透入细胞 ［5］。我们首先探寻出最佳的作用浓度和时间，以此DEM浓度和时间(0.6μmol/L，30分钟)作用于内皮细胞，发现此细胞内GSH浓度迅速而短暂的下降，完全符合DEM为巯基耗竭剂的作用机制。DDAH活性出现明显的降低，至2小时时DDAH活性降幅达80.07%，2小时后，DDAH的活性回升。
　　
　　对NO浓度的监测显示出其与DDAH活性非常相似的变化趋势。因为目前并无证据表明NOS的活性中心含有易受氧化损伤的巯基基团。提示DDAH的巯基受损是NO通路功能障碍的重要机制，保护DDAH的巯基、修复巯基损伤应是对抗各种NO通路损伤因素、包括氧化应激损伤的重要途经之一。

参考文献

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