幽门螺杆菌对克拉霉素耐药分子机制研究进展

【摘要】 幽门螺杆菌(Hpylori，Hp)是慢性胃炎，消化性溃疡的重要致病因素。研究表明，Hp的根治和清除有利于溃疡的治愈。而Hp耐药直接影响Hp的根治和清除，Hp耐大环内酯类药物(克拉霉素)的机制与其23S rRNA的V区上的点突变有关。随着Hp耐药率的逐年升高，有关Hp的耐药分子机制和检测技术成为研究热点。因此，开展Hp耐药的相关研究对Hp的诊断和治疗有重大意义。

【关键词】 幽门螺杆菌;耐药性;克拉霉素;分子机制

克拉霉素是新一代的大环内酯类抗生素，由于其抗Hp作用强，而成为根除Hp治疗方案中的主要药物。但Hp可对其产生耐药性，耐药菌株的出现是导致根除治疗失败的主要原因[1-3]。我国近年才开始应用克拉霉素，Hp原发耐药菌株的出现可能主要与同类药物交叉耐药有关，治疗失败时大约1/2～2/3的菌株可对其产生获得性耐药。因此，研究Hp的耐药情况、耐药机制和检测手段对指导临床用药以及疗效监测显得十分必要。本文就Hp对克拉霉素耐药作一综述。

　　1 Hp对克拉霉素的耐药情况

　　随着克拉霉素的广泛使用，Hp的耐药菌株也逐渐增多。Hp对克拉霉素耐药率在不同的国家和地区情况不尽一致。Kobayashi等人[4]研究发现日本的Hp克拉霉素耐药率从2002年的18.9%上升到2005年的27.7%，且有明显的性别差异(P&<0.0001)，其中男性19.2%，女性27.0%。他们还发现克拉霉素耐药率有地区差异。Kato等人[5]报道日本儿童的2002年克拉霉素原发耐药率为29.0%，Hp敏感菌株和耐药菌株的根除率分别为89.0%、56.0%。Hp继发耐药率(78%)明显高于原发耐药率(P&<0.01)。Kimet等人[6]报道韩国汉城Hp克拉霉素耐药率由1994年的2.5%上升至2003年的13.8%。Toracchio等人[7]对意大利中部研究发现克拉霉素原发耐药率和继发耐药率分别为23.4%、82.3%，克拉霉素原发耐药多见于女性。Elviss等人[8]报道北威尔士2004年的克拉霉素耐药率为7%，明显低于欧洲其他地方。Koivisto等人[9]报道芬兰的克拉霉素耐药率仅为2%，且与有口腔和呼吸道疾病的用药史有关。Boyanova等人[10]认为保加利亚的儿童克拉霉素耐药率和他们的居住地有关，这种差异可能和当地使用大环内酯类药物有关，居住在乡村的儿童克拉霉素耐药率为22.7%，明显高于居住在大城市的儿童耐药率(8.5%)。Osato等人[11]分别用Etest和agar dilution方法研究发现美国的克拉霉素原始和继发耐药率分别为12%和10.6%，性别和年龄对克拉霉素耐药有很大影响。Kaneko等人[12]研究显示在经过多重抗生素(包括克拉霉素)治疗的非结核性呼吸道感染患者的克拉霉素耐药率高达100%，提示应在进行长期的抗生素治疗前应根除Hp。Onder等人 [13]对土耳其110例Hp感染者研究发现，Hp的克拉霉素耐药率为48.2%，但其耐药率和性别、年龄、大环内酯类药物的使用、居住地、教育状况无相关性。Go?ciniak等人 [14]研究发现波兰1997-2001年的克拉霉素原发耐药率8.6%，治疗8周后耐药率达17.6%。中国地区也存在着地区和年龄的差异，成虹等人[15]调查发现北京1999-2000年的克拉霉素耐药率为10.0%，2000-2001年为18.3%，存在着上升趋势。陈洁等人[16]对浙江地区44例儿童临床分离菌株研究显示克拉霉素耐药率为18.2%，儿童耐药率高于成人。Hao等人[17]2004年报道中国东北地区克拉霉素耐药率为23.3%。

　　综上所述：(1)各国家或地区的Hp菌株对克拉霉素原发耐药率不同，耐药率为2%-48%，有明显的地域差异。克拉霉素耐药率在汉城、北京、日本、土耳其呈上升趋势，在意大利、芬兰、北威尔士呈相对稳定状态或下降趋势。(2)尽管有报道儿童克拉霉素耐药率高于成人，但克拉霉素耐药是否存在年龄、性别等差别，还存在争议。(3)目前多数学者认为，克拉霉素继发耐药率明显高于原发耐药率，抗生素(大环内酯类)的用药史与Hp交叉耐药、继发性耐药率的上升有相关性。

　　2Hp对克拉霉素的耐药机制

　　克拉霉素为14环的半合成新大环内酯类，因结构上其内酯环的6位羟基为甲氧基所替代，也称甲红霉素。这一结构上的修饰增加了其对酸的稳定性及抗菌活性。其作用于细菌核糖体50S亚单位，通过阻断转肽作用及mRNA位移而抑制细菌蛋白质的合成。作为根除Hp治疗方案的关键成分，对该药的耐药是治疗失败的主要原因。Bazzoli等人[18]报道克拉霉素敏感株及耐药株的根除率分别为95%和40%。大环内酯类抗生素能结合在野生型Hp的50S大亚基的23S单位上，抑制肽基酰基转移酶，影响核蛋白位移，抑制细菌蛋白合成和肽链延伸。而有耐药性的Hp的23SrRNA 的V 区上发生了点突变，导致核糖体的构象改变，使大环内酯类抗生素结合位点也随之发生改变，进而使Hp与大环内酯类药物亲合能力减粥，药物也就不能阻止细菌的蛋白合成，最终产生耐药。最多见的突变位点为A2143G。De Francesco等人[19]在对62株克拉霉素耐药菌株的研究中发现35株发生了A2143G突变(突变率为56.4%)，14株发生A2142G突变，8株A2142C突变，5株为A2143G和A2142G或A2143G和A2142C的同时突变。Francesco等人[20]还发现发生A2143G突变的菌株根除率最低(48%)， 但发生A2142G或A2142C 突变的菌株根除率仍可达到93%，提示A2143G突变对Hp对克拉霉素耐药进而影响其根除的作用最大。Posteraro等人[21]应用PCR依赖的高压液相色谱法检测到5个突变位点：A2142G，A2142C，A2143G，T2182C和C2195T。其C2195T的突变先前未曾发现过，此次与A2143G同时出现，显示克拉霉素仍有新的突变位点产生，其耐药机制尚需进一步研究。

　　3 幽门螺杆菌耐药生物学检测方法

　　3.1对Hp耐药的传统生物学检测方法

　　Hp耐药的传统生物学检测方法是取胃黏膜或组织，细菌增殖培养后，进行Etest、琼脂稀释法、纸片扩散法等体外药敏试验。Etest操作简便，但试纸价格昂贵;琼脂稀释法技术要求较高;纸片扩散法简便易行，但结果受多种因素的影响，不够准确。Hp培养要求高，时间长，不适合临床常规开展。Hp耐药的分子生物学检测方法建立在检测其核糖体23S rRNA点突变的基础上，根据是否需要基因扩增分为：(1)需要用基因扩增产物进行分析的，包括聚合酶链限制性片段长度多态性分析法(PCRRELP)、DNA测序法(Sequencing)、DNA酶免疫测定法(DNA enzyme immunoassay)、寡核苷酸连接试验(OLA)、3'端错配反向PCR(3'MPCR)、实时荧光定量PCR(realtime PCR)、基因芯片法(gene chip)、变性高效液相色谱法(DHPLC)等。(2)不需要用基因扩增产物进行分析的， 如荧光原位杂交(FISH)。1996年Versalovic等首先将PCRRELP用于检查Hp 23S rRNA的A2142G，A2143G的突变，该法以核糖体23S rRNA点突变为基础，通过PCR方法扩增发生突变的区域，由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点的出现，利用特异的限制性内切酶(MboⅡ，BsaⅠ)对PCR产物进行酶切，电泳分析，然后根据DNA片段长度的差异作出判断。该法简便易行，较为敏感，是检测AG突变常用的方法，但是该法的准确性受到临床标本以及非 Hp DNA扩增产物的影响，Alarcón等人 [22]用3'MPCR可以检测的23S rRNA A2142C的突变，其特点是运用一对特殊的引物。Realtime PCR将杂交技术和实时PCR以及融解曲线分析法三者有机地结合在一起，此方法不易污染，不需酶切，能同时对Hp感染进行定量和耐药性检测，而且适合于大量标本的检查。Elviss等人 [23]用Realtime PCR通过对溶解曲线的判断准确快速检测点突变，还比较了3'MPCR、Realtime PCR、PCRRELP，认为用3'MPCR检测点突变其敏感度和特异度都高于另外两种方法。DHPLC由Oefner于1995年建立，利用杂合双链和纯合双链部分变性温度不同，可以自动检测单碱基置换，小片段插入和缺失。 Posteraro等人 [24]用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，能检测A2142G，A2143G，A2123C，T2182C，C2195T五个位点的突变。临床实践证明，DNA测序则是检测基因突变位点的金标准。

　　3.2 基因芯片技术对Hp耐药的检测

　　近年来，基因芯片(Gene chip)技术发展迅速，已广泛应用于疾病研究、疾病诊断、基因测序、药物筛选等方面。基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术的基础上的，其原理是将大量的探针分子固定在支持物上，与标记的样品DNA进行杂交，可根据碱基互补配对的原则确定靶DNA序列，通过激光共聚集仪扫描，检测杂交信号的强度和分布进行分析。基因芯片可以实现对上千个基因同步检测，国内外学者已经在尝试用该技术检测Hp耐药基因，且对Hp基因进行定性、定量及结构分析的研究。国内学者[25]制备和应用寡核苷酸芯片对Hp感染及其致病性相关的基因型和耐药性同时进行检测，该法将PCR技术与高通量芯片技术相结合，对检测对象的多种生物学信息进行检测，具有快速、高效的特点，具有较高的灵敏度，同时自动化读取手段可确保检测的特异性和客观性，减少人为误差，这对多种基因的比较研究非常有利。但也存在一些问题：样品的制备与标记比较繁琐，芯片的制备较为复杂，仪器昂贵，费用较高等。随着科学技术的不断发展，基因芯片技术也会逐渐成熟和完善，基因芯片技术对Hp耐药的检测有着极为广阔的应用前景。

　　随着各国学者对Hp耐药检测技术研究的进展，取材方式也经历了一个发展过程：(1)胃镜下取胃组织或黏膜，细菌培养，提取菌株DNA，再进行各种分子生物学方法检测。(2)直接从胃活检标本中提取DNA，省去了培养步骤，快速简便。(3) Chattopadhyay等人[26]报道不需要抽提DNA的实验方法，胃镜下取胃黏膜或组织置于无菌塑料管，加120mL磷酸盐缓冲液(PBS)，剧烈振荡2min，开水浴15min后冰上冷却，13000g离心1min，吸取上清液进行PCR扩增。(4)粪便取材，Fontana用巢式PCR方法对粪便进行扩增[27]，产物用MboⅡ，HhaⅠ，BsaⅠ进行酶切可检测A2142C/G，T2717C，A2143G的突变.粪便取材属非创伤性，但由于粪便中Hp含量较低，杂菌较多，尤其是粪便中的胆红质，胆盐及一些重金属离子等可抑制Taq DNA聚合酶的活性，给实验带来一定的难度，如何去除抑制物是实验成功的关键.以上取材方式中，胃镜下取材适用于有内窥镜检查指征的患者，如十二指肠溃疡、早期胃癌等。粪便取材方便且无痛苦，无创伤，尤其适用于对Hp的克拉霉素耐药性的流行病学查，以建立本地区的Hp耐药的流行病学资料，指导临床合理用药。

　　4 结语

　　随着抗生素的广泛适用，Hp的耐药率逐渐上升。目前，Hp对克拉霉素耐药的分子机制已基本明确，有关耐药的检测手段的研究也较多，但大多数方法费时、繁琐。因此，研究和建立简便、快速、准确的耐药检测方法，将对建立流行病学资料和指导临床合理用药有着重要的作用。基因芯片技术可对多种基因同时、快速进行检测，且具有高通量、高灵敏度的特点，有着极为广阔的应用前景。

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