藏酋猴类似人clock基因片段的克隆

　　 作者：李韦 江舟 王红星 周亮 关俊文 刘延友 汪宇辉 王正荣

【摘要】 目的：在藏酋猴中，寻找和克隆与人clock基因类似的基因。方法：提取藏酋猴外周血白细胞RNA，逆转录为全基因组cDNA，利用人clock基因保守序列设计相关引物，克隆，测序，进行生物信息学分析。结果：扩增得到1994bp的核酸序列。该序列与人，苏门答腊猩猩，绵羊，小鼠，褐家鼠，原鸡和蟾蜍clock基因核酸序列同源性分别为99%，98%，94%，90%，90%，82%和75%。结论：藏酋猴基因组中存在与人clock基因相似的基因，该基因可能为藏酋猴clock基因。

【关键词】 藏酋猴 人 clock基因 克隆

藏酋猴(Macaca speciosa thibetanas)广泛分布于西藏东部和四川西部，海拔高度1500～2500米的山地阔叶林地区，是我国特有的猕猴种。其体型粗壮，是中国猕猴属中最大的一种，野外或人工繁殖成活率高，各种生理学特点与恒河猴基本一致，是一种理想的实验动物[1]。

　　近日节律(Circadian rhythm)是一种广泛存在于生物体内的节律现象，其周期在20～28小时之间，该节律是生物体内最强的生物节律。近日节律是当前研究最多以及物质基础相对研究得最清楚的生物节律。该节律是内源性的，通常情况下，生物钟自激振荡，同时因机体生活在以昼夜交替的自然环境中，表现出以24小时为周期的特点。生物钟系统的结构基础为一系列具有正向或负向调节功能的钟基因及其产物，包括Clock、Per1、Per2、Per3、Bmal1、Cry1、Cry2、Timless等。在哺乳动物中，clock基因具有很高的同源性，在近日节律系统中起着中心作用[2-5]。

　　到目前为止，猕猴的clock基因的研究尚未见报道。本实验将通过人等多种哺乳动物clock基因的保守序列设计PCR引物，试图在藏酋猴寻找clock基因。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料及试剂

　　提取总RNA所用材料为取自四川省医学科学院动物实验所人工饲养藏酋猴静脉血液。TRIZOL Reagent(Invitrogen公司);RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis Kit(Fermenta公司);Taq DNA polymerase(NEW ENGLAND公司);E.Z.N.A. Gel Extraction Kit(Omega公司);pBST克隆试剂盒(天根生化公司);其余常规试剂均为国产或进口分析纯。实验器材均由本实验室提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 clock基因部分序列的克隆和测序 先用淋巴细胞分离液分离得到外周血白细胞。再利用Trizol一步法提取总RNA。按RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis Kit操作手册和成cDNA第一链。从GenBank数据库中检索到人Homo sapiens(BC041878)，褐家鼠Rattus norvegicus(NM_021856)，小鼠Mus musculus(NM_007715)，绵羊Ovis aries(NM_001130932)苏门答腊猩猩Pongo abelii(NM_001132234)等5种哺乳动物clock编码区全序列，比对序列，根据保守序列设计引物如下(由Invitrogen公司合成)：

　　表1

　　PrimerSequenceP1F5'AGAGTATCTAGAAACAAATCTGAAAAGAAACG3'P1R5'CTTTATGTTTTCGTAAAAAATCAATGC3'P2F5'GGCACAGTCAGCAAACAT3'P2R5'CTGCCTGTCCTGAGTGAA3' 分别以P1F，P1R和P2F，P2R为引物，合成的第一链cDNA为模板做PCR。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。目的扩增产物割胶纯化(E.Z.N.A. Gel Extraction Kit)后与载体连接(pBST克隆试剂盒)并转化感受态细胞，涂验证平板，随机挑取阳性克隆提取质粒，进行序列测定(由Invitrogen公司完成)。根据测序结果和之前比对的6种哺乳动物clock编码区保守序列，设计引物如下：

　　表2

　　PrimerSequenceP1F5'AGAGTATCTAGAAACAAATCTGAAAAGAAACG3'P3R5'AACATGATTTGCCTTTCCCATATTG3'P4F5'ATGCAATATGGGAAAGGCAAATC3'P4R5'ATCTTATCTGCCTGTCCTGAGTGAA3' 再重复之前PCR及目的产物测序方法，得到分别以P1F，P3R和P4F，P4R为引物的目的PCR产物序列。

　　1.2.2 序列分析 采用DNAMAN Version 5对所克隆的四条片段基因序列进行比对，根据相同序列进行拼接得到一条长序列，并对基因序列和氨基酸序列进行同源性比较。用ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)进行ORF查找。

　　2 结果

　　2.1 PCR产物以合成的第一链cDNA为模板，P1F，P1R;P2F，P2R;P1F，P3R;P4F，P4R 4组引物分别做PCR。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，见图1。分别进行基因克隆和测序。

　　图1 RTPCR扩增基因cDNA片段

　　2.2 测序结果测序得到4条片段大小分别为：F1(引物：P1F，P1R)106bp，F2(引物：P2F，P2R)175bp，F3(引物：P1F，P3R)905bp，F4(引物：P4F，P4R)1106bp。通过重叠相同序列部分拼接出一条1994bp的基因序列pmClock，ORF Finder搜索开放阅读框，该核酸序列可编码一条含664个氨基酸的氨基酸序列。

　　2.3 基因序列及氨基酸序列比较 所得到的基因片段核酸序列与人clock基因编码区序列(GenBank：BC041878)比较，同源性为99%，编码区10个碱基位点差异，但翻译氨基酸均没有差异。与苏门答腊猩猩，绵羊，小鼠，褐家鼠，原鸡，蟾蜍clock基因核酸序列同源性分别为98%，94%，90%，90%，82%和75%。

　　3 讨论

　　clock属于转录调节因子bHLHPAS家族(Basical helixloophelixPAS family)，在各个物种均较为保守。clock含有bHLH结构域和PAS A及PAS B结构域，此外其C端还有一个富含谷氨酰胺的结构域QRich。bHLH参与蛋白质蛋白质相互作用以及蛋白二聚体的形成，PAS结构域介导与DNA结合。而C端富含谷氨酰胺，参与转录激活[6]。通过比对核酸序列和氨基酸序列，我们所克隆到的藏酋猴cDNA基因片段，可能是藏酋猴的clock基因片段或者是一个clock基因的类似物的片段。

　　Atchley等通过找出bHLH蛋白氨基酸组成高度保守的19个位点，建立了bHLH序列的预测序列，即一条未知序列在19个保守位点中有11个以上位点的氨基酸与预测序列相符，则可说明此未知序列为bHLH家族。另外，由于Loop的结构特点，以及长度的不确定性，优化得到预测bHLH基本模式如下：

　　++X(3–6)E+XRX(3)aNX(2)bX(2)L+X(5–22)+X(2)KX(2)cLX(2)AcXYaX(2)L

　　其中“+”代表K或R;“a”代表I，L或V;“b”代表F，I，L;“c”代表I，V或T;“E”，“R”，“K”，“A”和“Y”分别代表所对应得氨基酸;“X”代表任意氨基酸;“X(i)”代表i个任意氨基酸;“X(ij)”代表ij个任意氨基酸。通过比对所得pmClock序列发现，其中有12个位点与预测序列保守位点相符。说明该部分很可能是bHLH结构[7-9]。

　　通过与已知人Clock氨基酸序列PAS A及PAS B结构域序列比对，发现所获得pmClock氨基酸序列包含完整的PAS A及PAS B结构序列。所以，我们通过克隆得到基因片段具有典型的bHLHPAS结构。

　　4 结论

　　本实验利用软件对几种哺乳动物Clock基因序列进行分析，找出保守区域，设计引物，首次克隆到我国特有猕猴种藏酋猴类似Clock基因的部分片段，为以后克隆基因全长序列奠定一定基础，为进一步探究该基因的功能特点和遗传特点等研究提供相关基础资料。

参考文献

　1 《四川资源动物志》编辑委员会.四川资源动物志[M].成都:四川科学技术出版社，1984，51-54.

　　2 Harmer SL， Panda S， Kay SA， et al. Molecular bases for circadian clocks[J]. Annu Rev Cell Dev Biol，2000，17(2):215-253.

　　3 RepPert SM， Weaver DR. Molecular analysis of mammalian circadian rhythms [J]. Annu. Rev. Physiol，2001， 63 (5):647-676.

　　4 Young MW， Kay SA. Time zones: a comparative genetics of circadian clocks [J]. Nat. Rev. Genet，2001， 2(4): 702-715.

　　5 Etchegaray JP， Lee C， Wade PA， et al. Rhythmic histone acetylation underlies transcription in the mammalian circadian clock [J]. Nature， 2003， 421(2): 177-182.

　　6 Steeves TD， King DP， Zhao Y， et al. Molecular cloning and characterization of the human CLOCK gene: expression in the suprachiasmatic nuclei [J]. Genomics，1999，57(2): 189-200.

　　7 William RA， Werner Terhalle， Andreas Dress. Positional dependence， cliques， and predictive motifs in the bHLH protein domain [J]. J Mol Evol，1999， 48(2): 501-516.

　　8 Ledent V， Vervoort M. The basic helixloophelix protein family: comparative genomics and phylogenetic analysis [J]. Genome Res，2001，11(5): 754-770.

　　9 Hogenesch JB， Chan WK， Jackiw VH， et al. Characterization of a subset of the basichelixloophelixPAS superfamily that interacts with components of the dioxin signaling pathway.[J].J Biol Chem，1997，272(13): 8581-8593.