去势大鼠骨髓细胞CD44的表达及其意义

【摘要】 目的：观察CD44在去势大鼠骨髓细胞中的表达情况，探讨CD44对大鼠去势后骨髓细胞分化的作用和意义。方法：采用免疫组织化学方法，观察CD44在SD大鼠去势后4周、8周、12周骨髓细胞中的表达。结果：CD44在去势组和对照组中均有表达，CD44阳性染色主要见于单核细胞融合的多核巨噬细胞/破骨样细胞中，去势后各组动物骨髓细胞CD44表达均显著高于对照组。结论：CD44可能参与大鼠去势后骨髓细胞的分化，可能在骨髓单核细胞向破骨细胞分化中发挥重要作用。

【关键词】 CD44;去势;破骨细胞

骨质疏松是常见的老年病之一。骨质疏松症是以骨量下降，骨组织显微结构褪变，骨脆性增加、骨强度降低为特征的一种全身性疾病。骨形成和骨吸收的失衡是其主要病理特征。破骨细胞属于单核/巨噬细胞谱系细胞，受多种调控因子的直接或间接调控，经增殖、分化、融合发育成为多核的成熟的破骨细胞[1]，破骨细胞的形成与分化在骨形成和骨吸收失衡过程中发挥直接作用。CD44是重要的细胞黏附分子，在多种细胞中均有表达，参与细胞与细胞之间或细胞与细胞外基质之间的相互作用，具有多种功能。目前研究发现，CD44在破骨细胞或巨噬细胞的形成和功能调节中具有重要作用[2-4]。因此，本文通过研究SD大鼠去卵巢后骨髓细胞CD44表达的变化情况，探讨CD44在骨髓细胞分化过程中的意义，为深入研究骨质疏松症的发病机制提供线索。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂

　　多聚甲醛、EDTA、Triton X100等购自sigma公司;CD44抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司;免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.2 仪器

　　OLYMPUS显微镜(日本);石蜡切片机(德国LEICA);ImagePro Plus图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)

　　1.3 动物

　　健康3月龄雌性SD大鼠，200±50g，由四川大学华西实验动物中心提供。

　　1.4 方法

　　1.4.1 动物模型

　　3月龄雌性SD大鼠28只，体重200±50g，随机分成4组，分别为去势(Ovariectomy，OVX)4周组、去势8周组、去势12周组和假手术组(Sham operation，SX)，每组7只。经2%戊巴比妥钠(40mg·kg-1)腹腔麻醉后，OVX组进行双侧卵巢切除手术，SX组只进行单纯的开腹、关腹手术。术后各组动物分笼饲养，自由摄食饮水。各组动物分别于术后4周、8周、12周，经2%戊巴比妥钠(40mg·kg-1)腹腔麻醉后，4%多聚甲醛灌注固定，取L5椎骨，EDTA脱钙，常规石蜡包埋，制作7μm石蜡切片，进行HE染色和Masson三色染色，分析骨小梁变化情况。

　　1.4.2 CD44免疫组化ABC法染色

　　石蜡切片60℃烤片30min，依次入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、75%乙醇各10min，0.01M PBS漂洗，10min×2;15%h3O2室温处理30 min，0.01M PBS漂洗，10min×2;切片置0.01M枸橼酸盐缓冲液(PH 6.0)进行抗原微波修复15min，0.01M PBS漂洗10min×2;3%羊血清(0.3%Triton X100， 0.01M PBS配制(PH 7.3-7.4下同))37℃孵育30 min，不洗;切片滴加一抗(CD44效价：1:250，3%Triton X100配制)37℃ 孵育2h，4℃过夜，0.01M PBS漂洗，10 min×2;滴加相应入二抗(浓度1:200 )37℃孵育1h，0.01M PBS漂洗，10 min×2;滴加 入三抗(浓度1:100)37℃ 孵育1h，0.01M PBS漂洗，10 min×2;0.05%DAB显色3min，0.01M PBS漂洗，10 min×2;苏木素复染1min，1%盐酸酒精分色，1/600氨水蓝化;梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照以0.01M PBS替代一抗，其它步骤不变。

　　1.5 图象采集及数据分析

　　本实验采用OLYMPUS数码照相机采集图象，应用图象分析系统(C.IMAGING SYSTEMS USA)进行骨小梁形态计量分析。免疫组化定量分析采用ImagePro Plus 图像分析系统，每张切片高倍镜(400×)下分析吸光度值，每张切片选取3个视野，每组动物选取5张切片，计算各组平均吸光度值。实验数据以平均数±标准差表示，采用SPSS11.0统计软件进行t检验分析，以P&<0.05为差异显著。

　　2 结果

　　2.1 去势12周后骨小梁退变情况

　　去势后12周，OVX组大鼠椎骨骨小梁严重退变，骨小梁稀疏，断裂(图1)，骨小梁形态计量分析显示与对照组差异显著(表1)。表1 去势12周大鼠椎骨骨小梁参数变化情况

　　2.2 大鼠去势后骨髓单核细胞CD44的表达

　　CD44在去势组和对照组中均有表达，CD44阳性染色主要见于单核细胞融合的多核巨噬细胞/破骨样细胞中。在对照组中，CD44阳性的多核巨噬细胞/破骨样细胞散在分布于骨髓中，数量较少;大鼠去势后，CD44阳性的多核巨噬细胞/破骨样细胞数目增多，去势后各组动物骨髓细胞CD44表达均显著高于对照组(P&<0.05)(图2，图3)。

　　图1骨小梁Masson染色(×400) 去势后12周，大鼠椎骨骨小梁严重严重退变，骨小梁稀疏、断裂(B);对照组骨小梁排列致密、整齐(A)，形态计量分析显示二者差异显著。

　　3 讨论

　　绝经后骨质疏松的发生与雌激素水平下降明显相关[5]，由此可用手术直接切除动物双侧卵巢或子宫卵巢使雌激素水平降低，模拟绝经，诱发与女性绝经后相似的骨量丢失和骨结构改变，建立骨质疏松症的实验模型。本实验结果表明，雌性SD大鼠去卵巢后12周，椎骨骨小梁面积及数目减小，皮质骨厚度变薄，骨小梁面积和骨小梁平均宽度与对照组差异显著。此外，骨髓细胞中可见有大量的融合的多核巨噬细胞/破骨样细胞，表明骨髓细胞融合形成多核巨噬细胞/破骨样细胞在骨质疏松的发病过程中可能具有重要作用。

　　CD44是一种跨膜黏附分子，表达于B细胞、T细胞、粒细胞、神经胶质细胞以及各种肿瘤细胞等。CD44的配体主要有透明质酸、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白和胶原蛋白等。CD44主要参与细胞和细胞或细胞和细胞外基质之间的黏附，在炎症、淋巴细胞归巢、肿瘤转移中发挥重要作用[6-7]。在本研究中，我们发现CD44在去势组和对照组中均有表达，CD44阳性染色主要见于单核细胞融合的多核巨噬细胞/破骨样细胞中。在对照组中，CD44阳性的多核巨噬细胞/破骨样细胞散在分布于骨髓中，数量较少;大鼠去势后，CD44阳性的多核巨噬细胞/破骨样细胞数目增多，去势后各组动物骨髓细胞CD44表达均高于对照组。CD44介导细胞与细胞之间或细胞与细胞外基质之间的黏附作用，这种黏附作用使得细胞之间选择性黏附并使之定向分化。Cui等人的研究发现CD44可以通过激活NFKB而促进巨噬细胞的融合，包括组织巨噬细胞和骨髓中的破骨细胞[4]。Hyacinth等人的研究则表明，单核巨噬细胞在融合过程中高表达CD44，但是过高浓度的CD44则又抑制单核细胞的多核化[8]。目前就CD44在骨髓单核细胞向破骨细胞分化中的作用机制尚不完全清楚，其在骨质疏松症发病过程中的作用机制仍有待于进一步研究。

参考文献

　1 Vignery A. Macrophage fusion: molecular mechanisms[J]. Methods Mol Biol. 2008， 475(5): 149-61.

　　2 Ariyoshi W， Takahashi T， Kanno T， et al. Mechanisms involved in enhancement of osteoclast formation and function by low molecular weight hyaluronic acid[J]. J Biol Chem， 2005， 280(19): 18967-72.

　　3 De Vries TJ， Schoenmaker T， Beertsen W， et al. Effect of CD44 deficiency on in vitro and in vivo osteoclast formation[J]. J Cell Biochem， 2005， 94(5): 954-66.

　　4 Cui W， Ke JZ， Zhang Q， et al. The intracellular domain of CD44 promotes the fusion of macrophages[J]. Blood， 2006， 107(2): 796-805.

　　5 Kanis JA. Estrogens， the menopause， and osteoporosis[J]. Bone， 1996， 19(5 Suppl): 185S-190S.

　　6 Ponta H， Sherman L， Herrlich PA. CD44: from adhesion molecules to signalling regulators[J]. Nat Rev Mol Cell Biol， 2003， 4(1): 33-45.

　　7 Liang J， Jiang D， Griffith J， et al. CD44 is a negative regulator of acute pulmonary inflammation and lipopolysaccharideTLR signaling in mouse macrophages[J].J Immunol， 2007， 178(4): 2469-75.

　　8 Sterling H， Saginario C， Vignery A. CD44 occupancy prevents macrophage multinucleation[J]. J Cell Biol， 1998， 143(3): 837-47.