血浆氨基酸代谢谱与糖尿病相关性研究

　　　　 作者：韩晓菲 黄宇虹 王龙星 杨乾栩 肖红斌 张德芹

【摘要】 为了利用代谢组学手段研究血浆氨基酸代谢谱与糖尿病相关性， 采用邻苯二甲醛(OPA)柱前在线衍生反相高效液相色谱法，建立了血浆中21种氨基酸代谢谱的相对定量分析方法。衍生由自动进样器在线自动完成，紫外检测器检测，流动相A为10 mmol/L Na2HPO4Na2B4O7缓冲液(pH 7.95)，B为乙腈甲醇水 (45∶45∶10，V/V)， 线性梯度洗脱，流动相B在30 min内由5%增加至46%，27 min内21种氨基酸全部得到良好分离。用此方法测定了51位临床糖尿病人血浆氨基酸代谢谱。以相对峰面积作为原始数据，按血糖值高低预分组，通过Spss和Matlab软件平台，用线性判别分析、逐步判别分析和得分图进行关联研究，结果表明：血浆中氨基酸代谢谱与血糖值的高低存在相关性，对血糖值低于6.2的志愿者和血糖值高于9.5的志愿者，判别分析的总正判率达到了94.1%。逐步判别分析结果表明，有7种氨基酸(Arg， Cit， Asp， Asn， Thr， Leu， Trp)承载了上述分组的重要信息。其对上述分组的判别分析总正判率为90.2%，可作为反映血糖值高低变化的标志物组，对于糖尿病的早期诊断及深入研究具有潜在的科研及临床价值。

【关键词】 氨基酸; 高效液相色谱; 代谢组学; 糖尿病

　1 引 言

　　代谢组学作为系统生物学一个新的分支，在疾病诊断[1，2]等方面发挥着越来越重要的作用。与生物有机体代谢活动密切相关的代谢产物主要包括：糖类、脂质类、脂肪酸类、核苷类、蛋白质类、氨基酸类等。许国旺等通过代谢靶标分析，以尿中13～15种核苷类浓度为数据矢量，用主成分分析(PCA)法处理数据，对癌症病人和正常人进行分类研究，识别率达72%[3，4]。Yi等通过对糖尿病患者血浆中脂肪酸轮廓分析，用偏最小二乘线性判别分析(PLSLDA)模型进行了糖尿病患者和健康人的模式识别，得到了有价值的生物标记物信息[5]。目前，对氨基酸类代谢谱的代谢组学研究及其与疾病间的相关分析很少。

　　糖尿病是一种典型代谢类疾病，其多种并发症是影响患者生活质量的重要因素，对糖尿病早期及超早期发现与预防尤为重要。用代谢组学方法，寻找糖尿病代谢标记物并进行早期分类诊断，已成为糖尿病研究的重要方向 [6]。氨基酸作为代谢网络中重要的代谢物，与糖尿病存在相关性。本实验通过氨基酸类代谢谱的代谢组学法其与糖尿病的相关性，建立了血浆氨基酸代谢谱柱前在线衍生化HPLCUV方法，测定了51位志愿者血浆样本，结合多变量统计分析方法，对以血糖值为预分组指标的分类情况进行了关联分析。结果表明，血浆中20种氨基酸代谢谱与血糖值的高低有很强的相关性，其中有7种氨基酸对血糖值高低分组贡献率最大。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　1200型高效液相色谱系统，配备可变波长紫外检测器(美国Agilent公司)。氨基酸对照品:天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(PHe)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、瓜氨酸(Cit)、鸟氨酸(Orn)、牛磺酸(Tau)及内标物正缬氨酸(Norvaline)、邻苯二甲醛(OPA)、3巯基乙酸(美国Accostandard公司);乙腈和甲醇为色谱纯;MilliQ超低有机物超纯水机(美国Millipore公司)制备的超纯水。

　　2.2 样品采集与预处理

　　51份血浆样本取自天津中医药大学附属医院，血浆样本采集后，立即冷冻保存于-78 ℃冰箱中。B.S&<6.2的样本25例，B.S&>9.5的样本26例。样本在使用前均在室温解冻，准确移取血浆0.5 mL，加入冷HClO4 75 μL，内标溶液100 μL，涡旋混合振荡1 min，离心15 min(12000 r/min)，取上清液600 μL，加入5 mol/L 冷NaOH 189 μL，二次离心5 min(12000 r/min)，上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液用于氨基酸的分析。

　　2.3 在线衍生化方法

　　邻苯二甲醛(OPA)为衍生试剂：移取1 mL OPA储备液(10 g/L)， 加入硼酸盐缓冲液(pH 10.2)1 mL，再加入3巯基乙醇(3MPA)100 μL，混匀后，用0.22 μm滤膜过滤，待用。衍生化过程在Agilent 1200自动进样器上在线自动完成，程序如下：吸取磷酸盐缓冲液(pH 10.2) 50 μL;吸取样品、OPA 衍生试剂各5.0 μL，充分混合5次，等待1 min，进样。

　　2.4 色谱条件

　　Hypersil C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大连依利特公司);流动相A为10 mmol/L Na2HPO4Na2B4O7缓冲液(pH 7.95)， B液为乙腈甲醇水 (45∶45∶10， V/V)，柱温为40 ℃，流速为1.5 mL/min，进样量5.0 μL，梯度洗脱：流动相B在30 min内由5%增加至46%;紫外检测波长338 nm(谱带宽10 nm)，参考波长390 nm(谱带宽10 nm)。

　　3 结果与讨论

　　3.1 衍生化试剂

　　邻苯二甲醛(OPA)，常用、低毒，与伯氨基反应，在室温下只需30 s即完成反应，适合在线衍生、提高自动化程度及得到高的重复性。但OPA性质不稳定，极易氧化降解而失效 ，经实验验证，每3 d需更换一次，为保证高重复性，本实验中24 h更换一次，且实验中样品室设为5℃以降低其氧化速率。另外，因OPA只能与伯氨基反应，本实验中氨基酸谱只测定了血浆中丰度较高的伯氨基游离氨基酸。

　　3.2 血浆氨基酸高效液相色谱分析

　　Pietrzik等认为高半胱氨酸是心血管疾病的标记物，而且还是这种疾病的诱因[7]。Bφnna等不仅认为高半胱氨酸是心血管疾病的风险因子，而且还证明叶酸、VB12不能降低心梗后心血管疾病再发生[8]。血浆中单个氨基酸与疾病发生密切相关，对氨基酸代谢全谱分析也将成为代谢组学的重要部分。氨基酸分子量小，具有两性，有几对氨基酸(Asp/Glu， His/Gly， Arg/Ala， Val/Met)结构性质相近，不宜分离，采用经典的邻苯二甲醛为衍生试剂，正缬氨酸为内标物，用柱前衍生化方法建立了血浆中氨基酸代谢谱分析[9]。图1为血浆样品HPLCUV色谱图。从图1可见，在27 min内21种氨基酸(包括Gln)得到了很好地基线分离，其中难分离氨基酸对也得到了很好地分离，分离度均≥1。经优化后最终采用的方法具有仪器普适性强、分析时间短、样品用量少等优点。

　　3.3 方法学考察

　　对21种氨基酸组成的标准溶液，连续进样5次，峰面积的RSD为0.54%～3.97%。平行处理5等份同一血浆样本，峰面积的RSD在0.4%～4.3%之间。在加标回收实验中标准品加入量约为样品氨基酸含量的0.8倍和2倍，其回收率分别记为R1和R2， 平均回收率在72.1%～116.0%之间。由于目标小分子为内源性物质，在回收率实验中不能按照传统考察外源性物质的方法考察高、中、低不同浓度水平的加标回收率。在1.6～50 mg/L浓度范围内(进样体积为5.0 μL)，21种氨基酸的峰面积和浓度之间的线性相关系数r在 0.9944～0.9999之间。按10倍信噪比计算，21种氨基酸的定量检出限在6～60 ng之间。谷氨酰胺(Gln)由于在水溶液中不稳定，得到的精密度和重复性都不理想。同时，在用HClO4进行样品前处理时，可能影响了Gln原形的存在，使回收率不高，在后续数据处理时，不予考虑。

　　3.4 血浆氨基酸代谢谱分析与数据处理

　　51例血浆样本在分组时，结合临床诊断糖尿病的血糖值(B.S.)标准及本实验目的，按B.S.高低表1 仪器精密度、方法重复性、回收率及相关系数氨基酸标准加入量分别是样品氨基酸含量0.8倍和2倍的回收率(The recvoeries of amino acids added are 0.8 and 2 times as that in sample， respectively)。预分为两组，即B.S.&<6.2组和B.S.&>9.5组。样本经前处理、衍生化和色谱方法测定，得到氨基酸谱中各氨基酸的相对峰面积(分析物与内标物峰面积之比);在数据处理过程中，综合考察了代谢组学中常用的数据处理模式[10～13 ] ，利用SPSS 16.0软件平台，通过调用Discriminant模块中线性判别分析(Linear discriminant analysis)函数对氨基酸相对峰面积进行分析处理，得到分组的正判率和判别函数得分(Discriminant scores)。20种氨基酸通过逐步判别分析(Stepwise discriminant analysis)方法，利用MATLAB(Methods of multivariate analysis)中逐步判别分析函数模块， 提取得到7种aa对分组最有意义。再利用MATLAB 2007a软件平台中的Gscatter函数，

参考文献

[14]中的数据处理方式，用TPDA方法对以20种和7种氨基酸为变量的原始数据做Scores plot分析，得到更加直观的判别结果(图2)。

　　结果显示，用20种氨基酸谱作为分析变量进行线性判别分析，对B.S.&<6.2 预分组的正判率(hit ratio)达到92.0%，B.S.&>9.5预分组的正判率达到96.2%，总正判率达到94.1%。由此可见，用氨基酸代谢谱对血糖值高低分组进行模式识别有重要意义。通过逐步判别分析模式对原始数据进行处理发现，20种氨基酸代谢谱中有7种氨基酸(Arg， Cit， Asp， Asn， Thr， Leu， Trp)承载分组的信息量较大。用这7种氨基酸作为变量进行线性判别分析，结果与全部氨基酸的判别结果相近，总正判率达90.2%(图2)，二者没有显著性差别，说明两组血浆氨基酸代谢谱的差异，主要来自7种氨基酸，它们可以同时作为反映血糖值高低变化的标志物组。如图2显示，B.S.&<6.2组和B.S.&>9.5组能够很好地分开，但组内样本之间聚类不集中，可能与样本选取有关，在今后工作中还需进一步统一样本标准。

　　A判别结果：B.S&<6.2预分组，正判率92.0%; B.S&>9.5预分组，正判率96.2%;总正判率为94.1%。B判别结果：B.S&<6.2预分组，正判率88.0%; B.S&>9.5预分组，正判率92.3%;总正判率为90.2%。其中带标号的样本点为错判的样本号(A classification results: B.S&<6.2 pregroup， hit ratio 92.0%; B.S&>9.5 pregroup， hit ratio 96.2%;total hit ratio 94.1%. B classification results: B.S&<6.2 pregroup， hit ratio 88.0%; B.S&>9.5 pregroup， hit ratio 92.3%; total hit ratio 90.2%. The point with a label in graph refers to the number of sample discriminated wrongly)。 通过以上研究，氨基酸代谢谱与糖尿病血糖高低之间存在相关性，并且有7种氨基酸(Arg， Cit， Asp， Asn， Thr， Leu和Trp)与血糖值高低密切相关，结合生物化学代谢网络，7种氨基酸中有4种(Arg， Asp， Asn和Thr)属于生糖氨基酸(Glucogenic amino acid)， Cit属于活跃代谢中间产物。阐明这些氨基酸代谢异常与血糖升高间的关系，能为糖尿病进一步研究提供更多信息。

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