高效液相色谱电喷雾串联质谱法测定蜂蜜中5种头孢菌素

　　　　 作者：李学民 曹彦忠 张进杰 范春林 刘晓茂 钱小清

【摘要】 建立了用高效液相色谱电喷雾串联质谱(LCMSMS)测定蜂蜜中5种头孢菌素残留量的方法。蜂蜜样品用磷酸盐缓冲溶液溶解，经Oasis HLB固相萃取柱净化。5种头孢菌素在C18柱上以乙腈水为流动相梯度洗脱条件下完成分离，电喷雾电离串联质谱在正离子多反应监测模式下进行测定。添加浓度在2～100 μg/kg范围时，回收率为84.2%～103.6%; 相对标准偏差为3.89%～9.08%。本方法头孢唑啉的定量限为10 μg/kg， 头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟的定量限为2.0 μg/kg。

【关键词】 高效液相色谱电喷雾串联质谱; 头孢菌素; 蜂蜜

　　1 引 言

　　头孢菌素是分子中含有头孢烯和头霉烯两类β内酰胺类的半合成抗生素，具有广谱强杀菌、能耐酸、耐青霉素酶及过敏反应发生率比青霉素低的特点， 主要对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌具有杀菌作用[1]。随着头孢菌素化学研究的不断深入，在动物养殖及疾病治疗中广泛应用，导致在动物机体组织中产生头孢菌素残留，对人体健康造成危害。因此，世界各国对部分动物源性产品中头孢菌素残留量均提出了限量要求，如美国FDA规定牛奶中头孢匹林最高残留限量(MRL)为20 μg/kg，牛肉未蒸煮可食组织中头孢匹林最高残留限量为100 μg/kg;欧盟规定牛奶中头孢菌素最高残留限量为20～100 μg/kg;日本肯定列表规定牛肉中头孢菌素最高残留限量为10～1000 μg/kg，蜂蜜中头孢菌素最高残留限量还未见报道。

　　牛奶、动物组织中头孢菌素残留量的检测方法有微生物法[2]、酶联免疫法[3]、薄层色谱法、凝胶电泳法[4]、高效液相色谱法[5～7]和液相色谱电喷雾串联质谱法[8，9]。本方法参考了文献[8]，研究了蜂蜜中5种头孢菌素的提取和净化效果。以磷酸盐缓冲溶液为提取液，采用固相萃取柱净化，液相色谱电喷雾串联质谱仪测定。本方法比文献[8]方法操作简单，样品不用乙腈提取和浓缩，回收率高，是一种既能定性又能定量的检测方法，完全适用于蜂蜜中5种头孢菌素残留量的检测。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　API 3000液相色谱串联四极杆质谱仪(美国应用生物系统公司)，配有电喷雾离子源;1100高效液相色谱仪(Angilent公司);液体混匀器;玻璃固相萃取装置;真空泵; pH 900型pH计(瑞士Precisa公司，测量精度±0.02)。Oasis HLB C18固相萃取柱(500 mg， 6 mL)：使用前分别用5 mL甲醇、10 mL水和5 mL磷酸盐缓冲溶液预处理，保持柱体湿润。

　　头孢唑啉(CAS：25953199)、头孢匹林(CAS：24356603)、头孢氨苄(CAS：16549567)、头孢洛宁(CAS：5575213)、头孢喹肟(CAS：118443893)标准物质由Sigma公司提供;甲醇、乙腈为色谱纯;乙酸、NaOH、Nah3PO4为优级纯;磷酸盐缓冲溶液(0.15 mol/L，pH=8.5)。其它试剂为分析纯。

　　2.2 液相色谱与质谱条件

　　液相色谱条件：流动相A为水，含 0.1%(V/V) 甲酸 ;B为乙腈。梯度洗脱：0～2 min， 95% A; 2～8 min， 40% A; 8～15 min， 95% A。流速：200 μL/min。色谱柱：ZORBAX SBC18 (150 mm×2.1 mm， 3.5μm);进样量：20 μL。

　　质谱条件：离子源为电喷雾离子源(ESI); 扫描方式：正离子扫描; 检测方式：多反应监测(MRM); 喷雾电压(IS)：5500 V; 雾化气(NEB)：0.055 MPa，气帘气(CUR)： 0.079 MPa，辅助气(AUIX)： 6 L/min;离子源温度400 ℃。其它MRM条件见表1。表1 5种头孢菌素的定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞气能量

　　1949 分 析 化 学第38卷第5期李学民等：高效液相色谱电喷雾串联质谱法测定蜂蜜中5种头孢菌素 2.3 标准工作溶液的配制

　　准确称取每种头孢菌素标准物质，分别用水配制成浓度为1.0 g/L的标准储备溶液。取适量头孢菌素标准储备溶液，用空白样品提取液配制成适当浓度的基质混合标准工作溶液。

　　2.4 样品处理

　　称取5 g蜂蜜样品于150 mL三角瓶中，加入25 mL磷酸盐缓冲溶液溶解样品，混匀，用5 moL/L NaOH溶液调节至pH=8.5。把样品溶液移至下接Oasis HLB固相萃取柱的贮液器中，以3 mL/min的流速通过固相萃取柱，先用5 mL磷酸盐缓冲溶液洗涤三角瓶并过柱，再用2 mL水洗柱，弃去全部流出液。用2 mL乙腈洗脱，收集洗脱液于刻度样品管中，在40 ℃用氮气吹干，用2 mL水溶解残渣，摇匀后，过0.2 μm滤膜， 供液相色谱电喷雾串联质谱仪测定。

　　3 结果与讨论

　　3.1 提取溶液的选择

　　根据蜂蜜样品的特点和被测物的性质，确定磷酸盐缓冲溶液作为提取液。通过回收率实验，比较了提取液中磷酸盐缓冲溶液浓度和pH值对5种头孢菌素回收率的影响。从图1a和b可见，当提取液中磷酸盐缓冲溶液浓度为0.15 mol/L，pH=8.5时，5种头孢菌素回收率最佳。因此，本方法使用pH=8.5， 0.15 mol/L磷酸盐缓冲溶液作为提取液。

　　3.2 固相萃取柱洗脱条件的选择

　　本方法比较了用1， 2和3 mL乙腈作为洗脱剂，对5种头孢菌素回收率的影响，结果见表2。实验表明，当洗脱剂用量为2 mL时，5种头孢菌素的回收率为94.5%～98.7%; 当洗脱剂用量为3 mL时，5种头孢菌素回收率没有明显改善。因此，本方法选用2 mL乙腈作为洗脱剂。表2 固相萃取柱洗脱剂用量对回收率的影响

　　3 mL Eluant头孢唑啉 Cefazolin92.798.797.6头孢洛宁 Cefalonium96.798.196.3头孢匹林 Cephapirin89.295.296.3头孢喹肟 Cefquinome95.896.995.4头孢氨苄 Cephalexin86.794.595.9 3.3 液相色谱柱的选择

　　分别使用μBondapak C18(300 mm×4.0 mm，10 μm)色谱柱和ZORBAX SBC18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)色谱柱对5种头孢菌素的色谱行为进行了比较。实验发现，这两种色谱柱的灵敏度均能满足要求。但μBondapak C18色谱柱流速为1.0 mL/min时，5种头孢菌素的峰形较宽; 当流速达到1.5 mL/min时， 5种头孢菌素的峰形较好，但进行质谱分析前需分流，对5种头孢菌素结果的测定产生一定误差; 而使用ZORBAX SBC18色谱柱不需分流，定量准确度优于μBondapak C18柱。因此，本实验选用ZORBAX SBC18色谱柱。

　　3.4 质谱条件的确定

　　采用注射泵直接进样方式，以5 μL/min流速分别将头孢唑啉、头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁和头孢喹肟标准溶液注入离子源，用正离子检测方式对5种头孢菌素进行一级质谱分析(Q1扫描)，得到质子化分子离子峰分别为m/z 456， 424， 348， 459和529， 再对分子离子进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息。然后对去簇电压(DP)、碰撞气能量(CE)、电喷雾电压、雾化气和气帘气压力进行优化，使分子离子与特征碎片离子对强度达到最佳。然后将质谱仪与液相色谱联机，再对离子源温度、辅助气流速进行优化，确定样液中5种头孢菌素离子化效率最佳条件，见表1。

　　3.5 线性范围和方法检出限

　　配制一系列含头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟和头孢唑啉的样品基质混合标准溶液，浓度范围为2.5～1000 μg/L之间。在选定的条件下进行测定，进样量为20 μL， 用峰面积对各被测组分的浓度作图，头孢唑啉、头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟的绝对量在0.05～20 ng范围内均呈线性关系，符合定量分析要求，其线性方程和相关系数见表3。在此操作条件下， 5种头孢菌素在添加浓度在2～100 μg/kg范围时， 其浓度在线性范围之内。样品中头孢唑啉的添加浓度为10 μg/kg， 头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁和头孢喹肟的添加浓度为2.0 μg/kg时， 所测谱图的信噪比大于10。因此，确定本方法头孢唑啉的定量限为10 μg/kg; 头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁和头孢喹肟的定量限为2.0 μg/kg。表3 5种头孢菌素回归方程和相关系数

　　3.6 方法的回收率和精密度

　　用不含5种头孢菌素的蜂蜜样品进行添加回收率和精密度实验，在2～100 μg/kg范围内添加3个不同浓度的5种头孢菌素标准溶液后，摇匀，放置2 h，然后按本方法进行提取和净化，用高效液相色谱电喷雾串联质谱仪测定，其回收率和相对标准偏差结果见表4。由表4可见，本方法回收率在84.2%～103.6%之间; 相对标准偏差在3.89%～9.08%之间。表4 5种头孢菌素添加回收率及精密度

　　3.7 方法的适用性

　　采用本方法对4种蜂蜜(油菜蜜、椴树蜜、荆条蜜、洋槐蜜)中的5种头孢菌素进行检测，以3个添加水平添加浓度(2～100 μg/kg)进行回收率实验，其分析结果见表5。从表5可以看出，4种蜂蜜的回收率在81.6%～106.8%之间; 相对标准偏差在4.01%～10.26%之间，说明本方法的适用性良好。表5 4种蜂蜜中5种头孢菌素的回收率

参考文献

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