作者：付艳艳 李肖燕 孙志伟 秦雪芹 夏莲 索有瑞 李玉林 尤进茂
【摘要】 采用3种不同衍生方法对胺类化合物进行标记，比较衍生效率的差别，给出最优方法：5-(2-羟乙基)-(苯并吖啶酮与N，N-羰基双咪唑(CDI)缩合形成的双敏感探针2-(苯并吖啶酮)-乙基咪唑酸酯(BAEIC)与胺的衍生效率最高，产物稳定。BAEIC在N，N-二甲基甲酰胺 (DMF) 溶剂中以4-二甲氨基吡啶 (DMAP) 为催化剂，在80 ℃条件下与胺反应生成的亲核取代物，不仅表现出强烈的荧光，同时具有很强的质谱离子化能力。估算了衍生物在乙腈和甲醇水溶液中百分离子化值δ在5.62%～58.08%和2.14%～56.58%范围内。本方法具有良好的重现性，激发和发射波长为λex/λem=280/510 nm，荧光检出限为0.12～0.59 μg/L(8.6～79 fmol)； 在线APCI-MS检出限为1.9～14 μg/L(544～825 fmol)。
【关键词】 液相色谱-质谱； 脂肪胺； 5-(2-羟乙基)-苯并吖啶酮； 2-(苯并吖啶酮)-乙基咪唑酸酯
Abstract With comparison of three different methods for the marking of amines compound，an optimal derivatization method was selected.5-(2-Hydroxyethyl)benzoacridine（HBA) reacts with coupling agent N，N′-carbonyldiimidazole（CDI) to form an activated amide intermediate 2-(benzoacridin)ethyl-imidazole-1-carboxylate（BAEIC).BAEIC，which is dual-sensitive probe，reacts preferably with amino compounds at 80 ℃ in the presence of 4-dimethylaminopyridine（DMAP) catalyst in N，N-dimethylformamide（DMF) solvent to give the corresponding sensitively fluorescent derivatives with an excitation maximum at λex of 280 nm and an emission maximum at λem of 510 nm.BAEIC-amine derivatives simultaneously exhibited high ionization potential with percent ionization（ changing from 5.62% to 58.08% in aqueous acetonitrile and from 2.14% to 56.58% in aqueous methanol.Derivatives were not only sensitive to fluorescence but also to MS ionizable potential.The fluorescence detection limits（S/N=3) were 0.12-0.59 μg/L.The online APCI-MS detection limits were 1.9-14 μg/L(S/N=5).
Keywords High performance liquid chromatography/mass spectrometry； Ａliphatic amines； 5-(2-Ｈydroxyethyl)benzoacridine； 2-(Ｂenzoacridin)ethyl-imidazole-1- carboxylate
1 引言
质谱和荧光技术广泛应用于环境科学、毒物学及生命科学等领域中，用于确定诸多生物活性分子的含量及化学结构[1~3]。环境中的胺多是由蛋白质、氨基酸等含氮类有机化合物经生物降解而成。大多数胺类化合物在亚硝化剂存在下可生成强致癌性的N-亚硝基化合物[4~8]，因此，检测环境中的胺具有重要意义。目前，检测胺的方法主要有气相色谱法[9]和离子交换法[10]。尽管方法简便易行，但由于灵敏度低而受到限制。为提高检测灵敏度和改善选择性，采用柱前或柱后衍生化是一种行之有效的手段。但测定胺类化合物所用试剂较多[11~14]，如常用荧光试剂FMOC-Cl衍生化时，过量试剂易造成柱效降低。此外，试剂对脯氨酸和半胱氨酸衍生物表现出很弱的荧光，准确定量存在困难。
尽管多种胺类测定试剂[15~18]具有很强的荧光灵敏度，然而它们在APCI-MS中的质谱离子化能力相对低，这对同时获得在线的高灵敏质谱鉴定十分不利。本研究制备了一种能同时满足荧光和质谱增敏的双敏感探针分子。结果表明，2-(苯并吖啶酮)-乙基咪唑酸酯(BAEIC)中间体与胺的亲核取代产物具有高荧光灵敏度及很强的质谱离子化能力。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
1100 离子阱液相色谱-质谱联用仪，配备四元梯度泵、在线真空脱气机、荧光检测器和自动进样器(美国 Agilent公司)；大气压化学电离源(APCI Source)； Delta 600半制备色谱(美国Waters公司)。F-7000荧光分光光度计(日本Hitachi公司)。12种脂肪胺标准品(美国Sigma公司)； 乙腈(色谱纯，禹王试剂公司)； 5-(2-羟乙基)-苯并吖啶酮(HBA，自制)； 2-(苯并吖啶酮)-乙基咪唑酸酯(BAEIC，自制)； N，N-羰基二咪唑(CDI)、 4-二甲氨基吡啶(DMAP)等其它试剂均为分析纯。
2.2 标准溶液配制
分别称取12种脂肪胺标品，用乙腈配成浓度为0.1 mol/L溶液，相应低浓度12种脂肪胺混合溶液(2.0×10-3 mol/L)用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)稀释而成。称取0.1156 g HBA用DMF定容至10 mL，浓度为０．０４ mol/L。称取0.1532 g BAEIC用DMF定容至10 mL，浓度为0．0４ mol/L。称取0.2 g DMAP，用DMF定容至10 mL，浓度为20 g/L。称取0.1 g CDI，用DMF定容至10 mL，浓度为10 g/L。
2.3 色谱与质谱条件
Akasil-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm， 美国艾杰尔科技公司)。流动相A：30 %乙腈(含20 mmol/L HCOONH4， pH 3.74)； 流动相B：100%乙腈。梯度洗脱程序：0~30 min，10 %~100% B，保持10 min。流速为1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃。荧光激发和发射波长分别为280和510 nm。质谱条件：大气压化学电离源(APCI source)，正离子模式，喷雾压力413 kPa，干燥气流量5 L/min，干燥气温度350 ℃，气化温度450 ℃，毛细管电压3500 V，电晕电流4000 nA(Pos)。
2.4 衍生方法
按3种方法进行衍生反应（见图解１）：（１）一步法 依次向安培瓶中加入200 μL HBA，200 μL DMAP，350 μL CDI和210 μL胺标准品，密封后于80 ℃水浴中振荡反应60 min，取10 μL，加190 μL乙腈稀释，进样；（２）两步法 依次向安培瓶中加入200 μL HBA，200 μL DMAP，350 μL CDI溶液，密封后于60 ℃水浴中振荡反应20 min，使HBA与CDI作用形成中间体BAEIC，加入210 μL 12种混合胺的标准溶液，密封后于80 ℃反应60 min，取10 μL， 加乙腈190 μL稀释， 进样；（３）中间体法 依次向安培瓶中加入200 μL BAEIC，200 μL DMAP，350 μL DMF，210 μL 12种混合胺标品，密封后于80 ℃反应60 min， 取10 μL， 加乙腈190 μL稀释进样。
图解1 衍生反应概况图（略）
Scheme 1 Derivatization scheme of 3 methods
HBA：5-(2-羟乙基)-苯并吖啶酮(5-(2-Hydroxyethyl)benzoacridine)；BAEIC：2-(苯并吖啶酮)-乙基咪唑酸酯(2-(Benzoacridin)ethyl-imidazole-1-carboxylate)；DMAP：4-二甲氨基吡啶(4-Dimethylamiopyridine)
2.5 样品处理
取适量污水，用HCl调节至pH 3.0，超声振荡1 min，使水中的脂肪胺变为相应的有机盐，过滤，量取滤液150 mL，旋干后，加80%乙腈5 mL，用0.1 mol/L NaOH调至碱性后直接用于衍生化。
2.6 百分离子化估计
中间体HBA的母核属含N、O杂环的高共轭平面分子，由于N和羰基O原子处于特殊的对位结构，分子内的异构化转变相对容易（见图解2）。
图解2 2-(苯并吖啶酮)-乙基咪唑酸酯衍生物在含乙腈水流动相中的异构化机理（略）
Scheme 2 Isomerization mechanism of 2-(benzoacridin)ethyl-imidazole-1-carboxylate derivatives in aqueous acetonitrile
分子A中N原子的孤电子对首先通过异构化作用转移至O原子，形成两性离子B。B的过渡态包含一个酚氧负离子，极易接受H+而产生季铵离子C导致分子的荧光猝灭。其猝灭程度与体系内含质子给予体(h3O)的浓度有关。借助不同质子给予体浓度下的荧光猝灭强度，即可计算出分子A在水相体系下的百分离子化δ值。当探针A溶在水相有机体系时，存在探针分子A、质子给予体E(h3O)和质子接受体AE的平衡，荧光猝灭常数表达为：
K=[AE] [A]·［Ｅ］（１）
[A]，[E]和[AE]为相应的平衡浓度，根据质量守恒定律，百分离子化值δ可定义为：
δ＝[AE] [A]０＝[AE] [A]＋［ＡＥ］（２）
假设未被离子化的A最初浓度为[A]0，荧光强度为F0，则：
Ｆ０＝Ｋ′φf[A]０(3)
Κ′为与仪器相关的常数，φf为A的量子产率。当A部分被质子化后，剩余A的荧光强度为F， 此时F可表达为:
F=K′φf(1-δ)［Ａ］０（４）
（此处，δ＝［ＡＥ］／［Ａ］０），结合等式（３）和（４）得出：
（Ｆ０-Ｆ）／Ｆ＝δ／（１-δ）（５）
结合等式(2)，(3)和(7)得到下式：
（Ｆ０／Ｆ）／Ｆ＝Ｋ［Ｅ］（６）
（[E]为质子给予体的平衡浓度，其值远比[A]或[AE]大，这样[E]≈CE，CE为质子给予体的最初摩尔浓度），于是(６)式改写为：
（Ｆ０-Ｆ）／Ｆ＝ＫＣＥ（７）
将等式(７)中（Ｆ０-Ｆ）／Ｆ代于等式(7)得到：
δ＝ＫＣＥ／（１＋ＫＣＥ）（８）
根据不同质子给予体浓度下的荧光猝灭值，求得等式(７)中的猝灭常数Ｋ值后，代入等式(８)中获得相应的百分离子化值δ。
3 结果与讨论
3.1 荧光光谱性质
当水相体系处于恒温条件时，随体系中质子给予体浓度的增高，BAEIC-癸胺衍生物的荧光强度降低，这主要是探针分子与质子给予体形成季铵离子导致荧光猝灭的结果。表1为探针分子在不同浓度乙腈和甲醇水溶液中的相对荧光强度及发射波长。结果表明：随质子给予体浓度增加，荧光强度逐渐降低，且发射波长明显红移，在乙腈中红移约39 nm，甲醇中红移约13 nm。
理论上，百分离子化值δ与加入水的体积百分数应呈线性关系。在乙腈中，水的体积分数为0~70%时线性良好； 进一步升高则偏离线性，主要是探针分子在低浓度乙腈中溶解度降低的缘故(δ=2.77+0.2414x，r=0.9921，x为水的体积百分数)。甲醇中也有相似的结果。当甲醇中水的体积百分数在0~40%时线性良好（δ=0.30+0.17996x，r=0.9896），再高则偏离线性。上述百分离子化值δ很好地揭示了探针分子具有良好的质谱离子化能力，因为APCI-MS离子化主要是分子在质谱离子室中被水分子溶剂化的结果。
表1 不同浓度乙腈、甲醇水溶液中BAEIC-癸胺的荧光强度及百分离子化值（略）
Table 1 Fluorescence intensity of BAEIC-decylamine in the presence of varying amount of water and corresponding calculated percent ionization δ values
注（note）：乙腈水或甲醇水中BAEIC-癸胺浓度为1.0×10-6 mol/L； F0为纯乙腈或甲醇中荧光强度，K由公式(7)得出，δ值由公式(8)得出（Final concentration of BAEIC- decylamine in each aqueous acetonitrile or methanol is kept at 1.0×10-6 mol/L；F0 was measured in 100% acetonitrile or methanol.K values were calculated according to the Eq.7；δ values were calculated according to the Eq.8 in each corresponding K value obtained）。
3.2 色谱分离
HBA或BAEIC与脂肪胺的衍生化反应随碱性催化剂、CDI用量、溶剂、衍生温度、衍生时间的不同，衍生产率有显著差异。以辛胺、壬胺、癸胺、十一胺、十二胺等对以上的衍生条件分别进行了优化。实验表明：衍生温度80 ℃，衍生时间60 min，催化剂为DMAP，共溶剂为DMF时具有最高衍生产率。在最优化条件下，考察了3种不同衍生化方法对衍生产率的影响。结果表明，在3种衍生方法中，方法A最差，方法C给出最高的衍生产率，方法B与C比较略差(强度降低约25 %) (见图１中A，B，C)。其主要原因为一步衍生过程中，胺先与缩合剂CDI反应形成中间体ACDI，随后HBA的羟基与中间体ACDI的反应是一个慢亲核取代过程，从而导致极低的衍生产率。方法C是一个直接亲核取代过程，产率达最高。尽管方法B采用两步法先形成中间体BAEIC，但部分胺优先与过量CDI反应形成中间体ACDI，因而产率低于方法C。此外，衍生过程存在少量水时，BAEIC峰强度大为降低，相应HBA和(HBA)2的峰强度加强(图１D)，主要原因是中间体BAEIC水解，生成的HBA在碱性催化剂下与过量的BAEIC作用形成双取代的双-(2-羟乙基苯并吖啶酮)-碳酸酯(HBA)2(m/z 605.6)。另外分离中产生小峰DMA，是碱性条件下DMF水解产生少量二甲胺的结果(m/z 361.7)。
图１ 标准脂肪胺衍生物的色谱图 （略）
Fig.１ Chromatograms for standard aliphatic amine derivatization
A：一步法(One step method)；B：两步法(Two step method)；C：中间体法(Intermediate reaction)；D：衍生过程存在少量水（Derivatization in the presence of a small of quantity water）； 峰（Ｐeaks）：C1.甲胺(Ｍethylamine)；C2.乙胺(Ｅthylamine)；C3.丙胺(Ｐropylamine)；C4.丁胺(Ｂutylamine)；C5.戊胺(Ｐentylamine)；C6.己胺(Ｈexylamine)；C7.庚胺(Ｈeptylamine)；C8.辛胺(Ｏctylamine)；C9.壬胺(Ｎonylamine)；C10.癸胺(Ｄecylamine)；C11.十一胺(Ｕndecylamine)；C12.十二胺(Ｄodecylamine)；DMY：二甲胺(Ｄimethylamine)；HBA：5-(2-羟乙基)-苯并吖啶酮(5-(2-Ｈydroxyethyl)benzoacridine)；BAEIC：2-(苯并吖啶酮)-乙基咪唑酸酯 (2-(Ｂenzoacridin)ethyl-imidazole-1-carboxylate)；(HBA)2：双-(2-羟乙基苯并吖啶酮)-碳酸盐（bis-(2-Ｈydroxyethyl)benzoacridine)-carbonate）。
3.3 质谱鉴定
所有BAEIC胺衍生物产生特征碎片离子峰质谱数据见表2。代表性C10胺衍生物的一级质谱、二级质谱及裂解模式见图2。
图2 BAEIC-癸胺衍生物质谱图:一级质谱(A)，二级质谱(B)（略）
Fig.2 APCI-MS/MS spectra of representative decylamine derivative：MS spectra(A)，MS/MS spectra(B)
3.4 线性回归方程、检出限和重现性
采用衍生方法C，进样量在21 fmol～43 pmol范围内，依据峰面积和进样量，对胺类化合物进行线性回归，所得各衍生物的回归方程、相关系数和检出限(S/N=3)见表2。对43 pmol脂肪胺衍生物平行测定6次，保留时间和峰面积的相对标准偏差在0.05%~0.08%和1.9%~2.5%范围内。
表2 脂肪胺衍生物的线性范围、回归方程、相关系数、检出限、线性范围和质谱数据（略）
Table 2 Linear regression equations，correlation coefficients，detection limits，linear range and MS data of amine derivatives
Y：峰面积（Peak area）；X：注射量（Injected amount）pmol；质谱线性范围未测 （Linear ranges of APCI-MS were not tested）.
3.5 实际样品的分析
曲阜小沂河水色谱分离见图3，水样中加胺标准品(5.0×10-4 mol/L)，按照实验方法处理并衍生化，所得河水中脂肪胺化合物含量及回收率见表3。
图３ 小沂河水中游离脂肪胺色谱分离图（略）
Fig.３ Chromatogram of aliphatic amine from water in Yihe river
色谱条件和峰号同图１Ｃ(Chromatographic conditions and peaks same as in Fig．１Ｃ)。
表3 沂河水中脂肪胺的含量及回收率（略）
Table 3 Content and recoveries of aliphatic amines from water in Yihe river
*由于与未知组分共洗脱故未进行定量(C2 was not determined owing to co-eluting with unknowcomponents)； **组分同时进行在线的质谱鉴定(Ｔhe component was appraised by the online mass spectrum simultaneously)。
4 结论
利用HBA和新合成的含N、O杂原子的双敏感探针BAEIC，对胺类化合物进行标记，比较了3种不同衍生方法产率的不同。结果表明：在建立的条件下，中间体BAEIC与胺的衍生产率最高，所得胺的衍生物不仅具有较强的荧光发光特性，同时具有很强的质谱离子化能力。本方法具有线性范围宽、重现性好、操作简便等特性，对实际样品小沂河水中游离脂肪胺的分析结果满意。
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