高效液相色谱串联质谱法测定蔬菜中氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺残留

　　　　作者：钱鸣蓉 章虎 吴俐勤 刘飞 王祥云 何红梅 陈志民

【摘要】 建立了蔬菜中氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺残留量的高效液相色谱串联质谱同时分析方法。蔬菜样品加入乙腈高速匀浆，提取液中加入无水MgSO4和NaCl，振荡离心后，取上清液稀释后直接进样，液相色谱串联质谱电喷雾正离子扫描同时分析氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺。以甘蓝、白菜、黄瓜、辣椒、番茄和茭白6种蔬菜为基质进行4个添加水平和5次重复性实验，结果表明， 添加浓度为0.01～5 mg/kg，蔬菜中氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺添加回收率为85.4%～105%，相对标准偏差(RSD， n=5) 为2.5%～12%，氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺的方法检出限(LOD)分别为0.0003 和0.002 mg/kg，定量限(LOQ)分别为0.001和0.006 mg/kg。本方法操作简单，灵敏度、回收率和重复性均良好。

【关键词】 氯虫苯甲酰胺; 氟虫双酰胺; 高效液相色谱串联质谱; 残留

　　1 引 言

　　氟虫双酰胺(C23h32F7IN2O4S)和氯虫苯甲酰胺(C18H14BrCl2N5O2)是两种新型杀虫剂，结构式见表1。其作用于鱼尼丁受体(RyRs)，通过破坏昆虫细胞质内Ca2+环境的稳定性而起到杀虫作用，对鳞翅目害虫具有高效杀伤力，对哺乳动物低毒[1，2]。氟虫双酰胺由拜耳公司和日本农药公司共同开发，杜邦公司以该化合物为先导，开发了氯虫苯甲酰胺。2008年这两种农药在我国取得临时登记，用于防治小菜蛾和甜菜夜蛾。

　　最近，谢文等[3]采用高效液相色谱串联质谱法测定茶叶中多种农药残留， Battu等[4]采用液相色谱紫外检测器分析、高效薄层色谱确证甘蓝、番茄、木豆、红辣椒和土壤中残留的氟虫双酰胺及其代谢产物，前处理采用乙腈提取、盐析、氯仿反提和活性碳吸附净化，操作较复杂，分析时间较长; Cabori等[5]采用液相色谱串联质谱正负离子切换扫描分析茄子、番茄、辣椒、苹果、梨和葡萄中氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺，内标法定量。沈崇钰等[6]采用固相分散萃取净化GCMS方法测定蔬菜中多种农药残留。本研究采用乙腈高速匀浆提取，稀释后直接进样，减少了样品净化步骤，节省了分析时间，降低了分析成本。样品稀释后无明显基质效应，使用溶剂标准溶液直接进行定量分析，避免了空白基质的筛选和基质标准溶液的配制。本研究通过优化质谱条件，实现了液相色谱串联质谱正离子扫描同时分析氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　液相色谱串联质谱， TSQ Quantum配Survey液相操作系统(美国Thermo Fisher Scientific公司);Luna C18 色谱柱(100 mm×2.0 mm， 3 μm，美国Phenomenex公司);IKA T18 basic均质器(美国VWR公司);Sorvall Primo R高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)。乙腈和甲醇(色谱纯，美国Merck公司);甲酸(色谱纯，美国Tedia公司);氟虫双酰胺标准品(纯度≥99%)和氯虫苯甲酰胺标准品(纯度≥99.5%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司);1 g/L标准储备液：分别准确称取标准品0.01000 g，用甲醇溶解并定容至10 mL， 0～4 ℃保存，实验中按需稀释。实验用水为去离子水。

　　2.2 实验方法

　　称取15 g(精确到0.01 g)粉碎样品于匀浆杯中，准确加入15 mL乙腈，在匀浆器上高速匀浆提取2 min;加入1.5 g NaCl和6 g无水MgSO4，涡旋振荡， 以4000 r/min离心5 min。取上清液1 mL至10 mL容量瓶， 加入4 mL乙腈，用水定容至10 mL，混匀，过0.22 μm有机滤膜，供液相色谱串联质谱测定。

　　2.3 色谱质谱条件

　　Luna C18色谱柱(100 mm×2.0 mm， 3 μm);柱温：20 ℃;进样量：5 μL;流动相：V(甲醇)∶V(含0.1%乙酸的5 mmol/L乙酸铵溶液)=6∶4，流速：0.2 mL/min。

　　质谱条件：电喷雾正离子扫描方式;检测方式：选择反应监测;喷雾电压：4200 V;毛细管温度： 350 ℃;雾化气: 2.5 L/h;气帘气：0.5 L/h;碰撞气氩气：0.2 Pa。定量离子对、定性离子对、碰撞能量等参数见表1。在此条件下，氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺保留时间分别为4.1和8.5 min(见图1)。表1 氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺的结构及质谱条件参数

　　3 结果与讨论

　　3.1 液相色谱质谱分析

　　采用“T”三通方式，对氟虫双酰胺和氯虫苯甲酰胺的质谱条件进行优化。优化时所用两种化合物浓度均为5 mg/L。负离子扫描时， 图1 浓度为0.001 mg/L，氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺的提取离子流色谱图

　　Fig.1 Extraction ion chromatograms of chlorantraniliprole and flubendiamide at 0.001 mg/L以甲醇水(50∶50， V/V)为流动相，在全扫描模式下，氟虫双酰胺的[M-H]-峰为基峰;在反应离子监测模式下，选择信号强且稳定的m/z 254， 274， 272为定性离子，以信号最强的m/z 254为定量离子。在优化碰撞条件下，m/z 254的峰强约为1×106;氯虫苯甲酰胺含有2个氯原子和1个溴原子，在全扫描模式下，以其同位素峰[M+2-H]-为基峰;在反应离子监测模式下，以m/z 204， 202， 147为定性离子，定量离子m/z 204的峰强约为8×104。

　　正离子扫描时，以V(甲醇)∶V(水， 含0.1%乙酸)=50∶50为流动相，氟虫双酰胺的[M+H]+信号不明显，[M+Na]+加合离子峰为基峰，优化后定量离子m/z 531的强度约为2×105;由于与Na+加合的离子信号稳定性较差，因此流动相更换为V(甲醇)∶V(5 mmol/L乙酸铵，含0.1%乙酸)=50∶50，获得了强度高且稳定的基峰[M+NH4]+，优化后的定量离子m/z 274的强度约为4×106，另两个定性离子为m/z 408和256。对于氯虫苯甲酰胺，正离子扫描，在以上两种流动相条件下，[M+2+H]+均是基峰，且强度相当，选择的定量离子m/z 453的峰强约为3×106，另两个定性离子为m/z 286和177。

　　经优化流动相和质谱参数，氟虫双酰胺在正或负离子模式下进行的反应离子监测结果均有较高灵敏度，可达到μg/L级;而氯虫苯甲酰胺在正离子模式下的反应离子监测灵敏度明显优于负离子模式。本实验以V(甲醇)∶V(5 mmol/L乙酸铵，含0.1%乙酸)=60∶40为流动相，正离子扫描反应离子监测模式同时检测氟虫双酰胺和氯虫苯甲酰胺，保证氟虫双酰胺和氯虫苯甲酰胺均有较高灵敏度。

　　3.2 提取净化条件的确定

　　近年来，农药残留分析逐渐向快速、高效方法发展，特别是2005年以来，QuEChERS(Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged和Safe)方法在全球逐渐得到广泛应用[7，8]。该方法采用乙腈涡旋提取，无水MgSO4去水，NaCl盐析，PSA等做分散萃取填料进行净化。为了使残留在蔬菜中农药得到充分提取，本方法采用匀浆提取代替涡旋提取，在满足分析灵敏度要求前提下，不采用PSA净化，直接稀释进样，降低分析成本，并减少分析时间。

　　3.3 线性范围与基质效应分析

　　用流动相稀释一系列标准样品，氟虫双酰胺和氯虫苯甲酰胺的浓度分别为0.1， 1， 5， 20， 100， 500和1000 μg/L。以浓度为横坐标，峰面积响应值为纵坐标，进行线形回归。氟虫双酰胺回归方程为Y=299118X+17754， r=0.999;氯虫苯甲酰胺回归方程为Y=70035X+24795， r=0.999。 图2 稀释2倍和10倍的样品提取液中氯虫苯甲酰胺(C)和氟虫双酰胺(F)的基质效应分析

　　Fig.2 Matrix effect analysis for chlorantraniliprole (C) and flubendiamide (F) in two and tenfold dilution sample extract

　　1. 溶剂(Solvent); 2. 甘蓝(Cabbage); 3. 黄瓜(Cucumber); 4. 辣椒(Pepper)。

　　本实验以甘蓝、黄瓜、辣椒为例，比较了提取后稀释2倍和稀释10倍进样的基质效应。选择空白甘蓝、黄瓜、辣椒样品各3份，参照2.2节所述步骤，在分别加入乙腈、无水MgSO4去水和NaCl提取离心后，吸取上清液，分别经水/乙腈稀释2倍和10倍后作为定容液，定容体系中乙腈与水的体积比为1∶1，氟虫双酰胺和氯虫苯甲酰胺的浓度均为0.1 mg/L。测定基质标样的响应值，与同浓度的溶剂标样响应值进行比较(图2)。由图2可见， 3种基质对氟虫双酰胺和氯虫苯甲酰胺的电离抑制程度相似。稀释2倍进样，氯虫苯甲酰胺基质标样响应约为溶剂标样响应值的79%～85%，氟虫双酰胺基质标样响应约为标样响应值的96%～102%;稀释10倍后，氯虫苯甲酰胺基质标样响应约为溶剂标样响应值的89%～93%，氟虫双酰胺基质标样响应约为标样响应值的96%～103%。因此，本实验将样品提取液稀释10倍后用于分析， 以减少基质效应，根据溶剂标样计算样品中农药含量。

　　3.4 方法的回收率和精密度

　　在未检出氟虫双酰胺和氯虫苯甲酰胺的甘蓝、白菜、黄瓜、辣椒、番茄和茭白样品中分别添加0.01， 0.2，2和5 mg/kg的2种农药标准液，涡旋混合2 min，静置30 min。每个水平平行5次，按照2.2所述步骤处理后进样，计算加标回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表2。回收率为85.4%～105%，RSD为2.5%～12%，与文献[4]报道的液相色谱串联质谱内标法测定蔬菜中这两种双酰胺类农药的方法回收率范围82%～107%相当。

　　3.5 方法的灵敏度(LOQ)

　　在优化的色谱质谱条件下，分析添加浓度为0.01 mg/kg，进样浓度为0.001 mg/L样品中氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺的分子离子峰图谱，对所选择的定性和定量离子对，以响应最小的离子对噪音信号的3倍和10倍计算方法的检出限和定量限。氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺的方法检出限(LOD)为0.0003 和0.002 mg/kg，定量限(LOQ)分别为0.001和0.006 mg/kg。我国还未规定蔬菜中氯虫苯甲酰和氟虫双酰胺残留限量，欧盟规定番茄、辣椒、茄子、黄瓜、中国大白菜、生菜和甘蓝中氯虫苯甲酰胺的残留限量为0.3， 1， 0.3， 0.2， 0.01 ，10和2 mg/kg，氟虫双酰胺的残留限量为0.2， 0.2， 0.01 ，0.01， 0.01， 0.01和0.01 mg/kg;美国规定番茄、黄瓜上的中氯虫苯甲酰胺的残留限量为0.3和0.1 mg/kg，番茄、中国大白菜、生菜和甘蓝中氟虫双酰胺的残留限量为0.7， 5， 15和3 mg/kg;日本规定番茄和生菜中氟虫双酰胺的残留量为0.3和11 mg/kg。可见所建方法能满足发达国家对蔬菜中两种农药残留检测的要求。

　　3.6 样品分析结果

　　随机抽取市场上的40个蔬菜样本(10个甘蓝，10个白菜，5个辣椒，5个番茄，5个黄瓜和5个茭白)进行检测。氟虫双酰胺均未检出，氯虫苯甲酰胺分别在1个甘蓝和茭白中检出，残留量分别为2.1和1.1 μg/kg。实验表明，氯虫苯甲酰胺在我国的甘蓝种植中已有使用。表2 方法添加回收率和精密度(n=5)

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