作者：温庆祥，杨洪志，尚菊菊，李爱勇，刘卫红，耿建国，刘红旭
【摘要】 目的 通过检测大鼠缺血心肌梗死面积的大小、血清一氧化氮合酶(NOS)变化、蛋白激酶C(PKC)的表达，探讨参元丹的药理性预适应作用及其机制。方法 选取清洁级健康成年Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重(274±42)g，鼠龄4月左右，随机分为6组，分别为对照组、再灌注组、假性缺血预处理组、缺血预处理组、药物预处理＋缺血预适应组、药物预处理组，每组10只。分别造模、取血、取心肌组织。将心肌组织浸入10%甲醛溶液中固定，脱水，封蜡，切片，染色。应用HE染色方法对组织切片进行染色，4倍镜下采用彩色病理图像分析系统分析心肌梗死面积。将所取血液离心后取血清，用紫外分光光度法检测血清总NOS的活力和分NOS的活力。应用蛋白激酶C(PKC)免疫组化试剂盒对组织切片进行处理，20倍镜下观察PKC表达情况。结果 参元丹能减少大鼠的心肌梗死面积，并与缺血预适应有协同作用，能够加强彼此的抗心肌缺血的能力。各组间血清NOS的变化差异无统计学意义(P＞0.05)。缺血预处理组、药物预处理＋缺血预适应组和药物预处理组的PKC有明显表达，其余各组没有表达。结论 参元丹能够减少心肌梗死的面积，具有药理性预适应样心肌保护作用，其作用机制可能与PKC介导有关。
【关键词】 药理性预适应；参元丹；心肌梗死；一氧化氮合酶；蛋白激酶C；大鼠
Abstract：Objective By detecting the infarct size of myocardial ischemia in rats， the changes of serum nitric oxide synthase (NOS) and the expression of protein kinase C (PKC)， to discuss the role of Shenyuandan pharmacological preconditioning and its mechanisms. Method Sixty clean healthy adult Wistar rats half male and half female， (274±42)g body weight， 4 months old， were randomly pided into 6 groups， respectively for the control group， reperfusion group， pseudo-ischemic preconditioning group， ischemic preconditioning group， drug pretreatment＋ischemic preconditioning group and drug pretreatment group， 10 rats in each group. Then made the modle， drawn blood， and took the cardiac muscle organization separately. The cardiac muscle organization was plunged into 10% formaldehyde solution to be fixed， dehydrated， wax sealed， slice cut and dyed. HE staining method was used to dye the tissue slice and the colored pathological image analysis system was used to analyze the cardiac arrest area. The activity of serum total NOS and sub-NOS was detected by ultraviolet spectrophotometry. PKC immunohistochemical tissue kit was applied to deal with the tissue and PKC expression situation was observed. Result Shenyuandan could reduce myocardial infarct size in rats， and synergistic effect of ischemic prrconditioning， so as to strengthen their ability of anti-myocardial ischemia. There was no significantly difference in serum NOS among groups (P＞0.05). There were obvious expression of PKC in ischemic preconditioning group， drug pretreatment＋ischemic preconditioning group and drug pretreatment group， but the rest groups not. Conclusion Shenyuandan was able to reduce the infarct size of myocardial ischemia in rats and had a pharmacological preconditioning-like myocardial protection， its mechanism may be related to PKC-mediated mechanism.
Key words：pharmacology preconditioning；Shenyuandan；myocardial infarcion；NOS；PKC；rat
缺血预适应(IPC)是心肌的一种内源性保护机制，即反复短暂缺血/再灌注以激发自身适应性反应，使心肌对随后发生的持续性缺血的耐受能力提高。本研究观察参元丹对大鼠心肌缺血预适应心肌梗死面积、一氧化氮合酶及蛋白激酶C的影响，以期为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物
健康成年Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重(274±42 )g，鼠龄4月左右，SPF级，北京天桥实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK11-00-0008。大鼠饲养和实验均在北京市中医研究所SPF级实验动物室内进行。
1.2 药物
参元丹胶囊为北京中医医院院内制剂(主要组成：黄芪、党参、元参、丹参、土鳖虫、水蛭等，批号：京药制字Z20053327，北京中医医院药剂科制)。根据临床参元丹应用剂量，等效换算后的7倍剂量为大鼠的灌胃剂量，然后根据每只鼠的重量换算其所需的灌胃药量。戊巴比妥钠(BDH，AR级，使用前用灭菌注射用水配制成3%的浓度)。
1.3 仪器
四通路生理记录仪(型号：AD INSTRUM ENTS Powerlab)，动物用呼吸机(型号：VL-8，上海奥尔科特科技有限公司)，721型光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂制造)，离心沉淀机(型号：Sigma-3-18K)，脱水机(德国)，石蜡包埋机(德国)，石蜡切片机(德国)，烤箱(德国)，光学显微镜(德国)，北航三高CMIAS99C型彩色病理图像分析仪等。
1.4 造模
1.4.1 心肌梗死模型制作
参考文献
[1]方法。大鼠麻醉后，于颈前和左前胸部被皮，先于颈部被皮处逐层切开皮肤、肌肉等组织，分离气管，行气管插管术，以蘸湿的消毒纱布覆盖，然后于胸部被皮处3～4肋间隙逐层切开皮肤、肌肉等组织，以开眼器撑开3、4肋，剥离心包后，以眼科弯镊夹住左心耳，于左心耳下1 mm处穿线，结扎冠状动脉左前降支。1.4.2 机械性缺血预适应模型的制作 参考心肌梗死模型制作方法，大鼠麻醉后，行气管插管术、开胸术，剥离心包后于左心耳下1 mm处穿线，手术线两端同时穿过一个塑料圆珠，拉紧手术线两端，塑料圆珠压迫冠状动脉左前降支造成心肌缺血， 5 min后松开手术线，恢复10 min，如此重复3次。
1.5 分组、给药及处理方法
将大鼠随机分为6组，每组10只。对照组：不做任何处理。再灌注组：缺血30 min，再灌2 h。假性缺血预处理组：机械性缺血预适应时只穿线，不结扎；10 min后，缺血30 min，再灌2 h。缺血预处理组：首先做3次机械性缺血预适应，10 min后，缺血30 min，再灌2 h。药物预处理＋缺血预处理组：灌胃参元丹2 h后，进行缺血预处理组过程。药物预处理组：灌胃参元丹2 h后，进行再灌注组过程。末次给药2 h后戊巴比妥钠腹腔麻醉，50 mg/kg，将动物背位固定在鼠台上，用6号针头置于四肢皮下，并与心电图机肢导联相连，监测Ⅱ导联心电图麻醉后和梗死后的变化，根据Ⅱ导联心电图的变化，以T波改变判断心肌缺血程度和药物作用。观察2 h后心脏取血，检测一氧化氮合酶(NOS)等生化指标。取血后，沿左右心耳剪取心脏，保留心耳以下部分，浸入福尔马林溶液固定，72 h后脱水，包埋，制成蜡块，以备染色及切片。部分组织标本浸入10%中性甲醛液中固定72 h后，逐级乙醇脱水，石蜡包埋，间断均匀切片(每片厚5 μm)，制成组织切片备检。对病理切片进行免疫组化染色，光学显微镜观察受损血管病理组织形态学改变，协同使用病理科彩色病理图像分析系统进行图像分析，测定蛋白激酶C(PKC)表达情况。使用来卡切片机进行切片，每片厚度为5 μm。57 ℃水浴捞片，57 ℃烘片机烘干，备用。根据所需不同使用不同的染色方法，分析各组心肌梗死面积和组织变化的使用HE染色法。
1.6 统计学方法
数据以x±s表示，利用SPSS15.0统计软件(SPSS Base15.0S PN：32119001 SN：5045602-L20080008)进行统计学处理，组间比较用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 电镜观察结果
经HE染色后，20倍光学显微镜下观察，梗死组织细胞肿胀、变形，细胞之间的界限不明显，甚至很多细胞破裂，细胞质流入细胞间隙。细胞间质增生，细胞排列杂乱。
2.2 不同的处理方法对心肌缺血大鼠心肌梗死面积的影响
在4倍显微镜下，采用彩色病理图像分析系统进行图像分析，对照组以心尖至切取部位最短垂直距离为测量标准，其余各组以心尖至梗死部位的最短垂直距离为测量标准，反映心肌梗死面积的大小。结果见表1。表1各组大鼠心尖至梗死部位的最短垂直距离比较(略)注：与对照组比较，**P＜0.01；与再灌注组比较，△△P＜0.01
2.3 不同的处理方法对心肌缺血大鼠一氧化氮合酶活力的影响(见表2、表3)表2不同的处理方法对各组大鼠NOS总酶活力的影响(略)表3不同的处理方法对各组大鼠NOS分酶活力的影响注：因动物取血死亡故各组数不同
2.4 蛋白激酶C表达情况
PKC主要表达在细胞浆和细胞膜，在细胞核上很少表达。它的经典表达方式是围绕着蓝色细胞核的棕褐色的分布，形成了大体的细胞的形状。PKC在正常的心肌细胞中基本不表达，或者仅有少量的表达，这种表达在显微镜下肉眼难以看到。所以，排除特殊情况后，PKC一旦表达呈阳性，就说明这种表达有意义。
在对照组和再灌注组的心肌组织中，PKC基本不表达；假性缺血预处理组的心肌组织中偶见微弱的一处表达，但是表达不充分。在缺血预处理组大鼠心肌组织中，PKC大量的表达，并且表达非常充分，存在的数量很多，提示PKC在大鼠预适应样心肌保护作用过程中存在。药物预处理组大鼠心肌组织的PKC表达充分，视野下PKC表达的数量多，经典的阳性表达形态完好，提示参元丹具有独立的药理预适应作用，PKC在参元丹的药理性预适应样心肌保护过程中起作用。药物预处理＋缺血预处理组大鼠心肌组织中PKC大量表达，由于表达的充分，无法分辨与缺血预处理组的数量差异。可能是缺血预适应与参元丹具有协同作用。PKC介导了参元丹与缺血预适应的预适应样心肌保护作用，并可能具有协同作用。
3 讨论
参元丹是临床经验方剂。方中重用黄芪和党参为君药，具有补气升阳作用；土鳖虫、水蛭破血逐瘀，地龙行经通络为臣药；玄参育阴软坚，丹参活血祛瘀，延胡索行气活血，是佐使之药。全方扶正益气与破血逐瘀同用，共奏益气养阴、破血逐瘀、通络止痛之功效。既往研究表明，参元丹治疗不稳定心绞痛具有较好的临床疗效，部分疗效机理可能是调整血浆NO、组织型纤容酶原激活物水平，促进血管内皮修复，调整凝血纤溶系统等实现的[2-3]。实验研究结果显示，参元丹具有拮抗肾上腺素引起的血管平滑肌收缩作用[4]；能够对抗垂体后叶素引起的大鼠急性心肌缺血[5]；抑制动脉内皮损伤后血管内膜过度增生，调整动脉内皮损伤大鼠内皮素/NOS比值及血管紧张素水平[6-7]。
缺血预适应是心肌的一种内源性保护机制，即短暂的缺血后能耐受随后较长时间的缺血损伤。现代研究证明，缺血预适应的机理是通过触发体内某些活性物质的活性，如腺苷、NO、阿片类物质以及缓激肽和缓激肽受体等，随后激活某些细胞内的信号传导途径，如PKC，进而通过一些效应因子而发挥心肌保护作用。ATP敏感钾通道(KATP)是受体激活后的效应因子的最终作用部位。缺血预处理分为快速相和延迟相，在快速相中起作用的主要有腺苷、PKC等；在延迟相中起作用的主要是NO、热休克蛋白等。
目前普遍认为PKC的激活是缺血预适应的重要环节。心肌细胞缺血时腺苷A1受体、α1肾上腺素能受体及乙酰胆碱M2受体等的激活导致PKC的激活。已有研究表明，PKC激活后能够通过磷酸化的途径激活KATP通道，产生了心肌保护作用。Qiu等[8]研究发现，PKC有11种亚型，但在缺血预适应传导途径中起主要作用的是δ和ε两种亚型。Akihito等[9]研究发现，PKC激活剂能产生与缺血预适应相似的心肌保护作用，其拮抗剂可以阻断这一作用。Liu等[10]认为PKC易化了KATP通道的开放过程。
本实验研究显示，参元丹具有药理性预适应样心肌保护作用；能够减少心肌缺血，减小心肌梗死的面积，对心肌缺血大鼠血清的NOS活力没有影响，药理性预适应心肌保护作用的机制与PKC介导有关。
参考文献
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3 刘红旭，金 玫，王振裕，等.参元丹与合心爽治疗不稳定性心绞痛血瘀证疗效观察[J].中国中医急症，2003，12(4)：293－294.
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6 刘红旭，尚菊菊，赵子厚，等.参元丹对动脉内皮损伤大鼠血管内膜增生影响研究[J].西医结合">中西医结合心脑血管病杂志，2006，4(2)：124－125.
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8 Qiu Y， Ping P， Tang XL， et al. Direct evidence thao proteinkinase C plays an essential role in the development of late preconditioning against myocardial stunning in conscious rabbits and that epsion is the isoforn involed[J]. Cire Res，1992，70(2)：184－186.
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10 Liu Y， Gao WD， O’ Rourke B， et al. Priming effect of adenosine on K (ATP) currents in intact ventricular mocytes imocytes implications for peconditionar[J]. Am J physical，1997，273：1637－1643.