作者：马佐英，何山，袁卫玲，郭茂娟，王学岭
【摘要】 目的 观察宣肺健脾中药哮逐平对支气管哮喘大鼠的治疗作用，探讨其可能的作用机制。方法 SPF级雄性Wistar大鼠32只，随机分为正常对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、地塞米松组(C组)、哮逐平组(D组)，每组8只。除A组外，其余组动物建立哮喘模型。HE染色，观察支气管-肺组织病理学改变，以医学图像分析软件测量支气管基底膜周径(Pbm)、支气管壁厚度(Wat)和平滑肌厚度(Wam)。免疫组化PV二步法染色，应用上述图像分析软件检测支气管-肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)的积分光密度(IOD)。结果 与A组相比，B组Wat、Wam和支气管-肺组织TGF-β1含量明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。经药物干预后，C、D组Wat、Wam减少及支气管-肺组织TGF-β1含量显著降低(P＜0.05)。D组Wat、Wam和TGF-β1减少尤为明显，与B组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中Wat、Wam与A组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。与C组相比，D组TGF-β1含量明显下降，差异有统计学意义(P＜0.01)。结论 宣肺健脾中药可能通过抑制哮喘大鼠支气管-肺组织TGF-β1的过度表达而影响平滑肌增殖、减轻气道壁增厚，干预气道重塑。
【关键词】 宣肺健脾中药；哮逐平；哮喘；气道重塑；转化生长因子-β1；大鼠
Abstract：Objective To observe the effect of bronchial asthma in rats treated by Chuanzhuping， a prescription which has the function of dispersing lung Qi and invigorating spleen Qi， and explore its possible mechanism. Method Thirty-two male Wistar rats of SPF level were pided into four groups randomly：control group (A)， asthma group (B)， Dexamethasone group (C) and Xiaozhuping group (D). Except group A， the others were established animal model of asthma. After drawing materials， hematoxylin and eosin (HE) staining were performed. The pathological changes in bronchopulmonary tissue of rats were detected. The basementmembrane perimeter (Pbm)， the airwaywall area (Wat) and the smooth musclewall area (Wam) were measured and calculated by using image analysis system. The concentration of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in bronchopulmonary tissue was observed by immunohistochemical method and the integral optical density (IOD values) of it was measured. Results In bronchopulmonary tissue of group B， Wat， Wam and the concentration of TGF-β1 increased， and were significantly different from that in group A (P＜0.01). In group C and D， Wat， Wam and the concentration of TGF-β1 decreased， and the concentration of TGF-β1 was significantly different from that in group B (P＜0.05). In group D， Wat and Wam were significantly different from that in group B (P＜0.05)， and were not significantly different from that in group A (P＞0.05). In group D， the concentration of TGF-β1 decreased and was significantly different from that in group C (P＜0.01). Conclusion In treatment of asthma， Xiaozhuping with the function of dispersing lung Qi and invigorating spleen Qi may affect airway remodeling by inhibiting the expression of TGF-β1， suppressing smooth muscle proliferation and decreasing the thickness of bronchial wall.
Key words：herbs of dispersing lung Qi and invigorating spleen Qi；Xiaozhuping；asthma；airway remodeling；TGF-β1；rat
近年研究发现，几乎所有的支气管哮喘患者均有不同程度的气道壁结构改变，除炎性细胞浸润、痉挛、导致气道狭窄外，还表现为气道壁增厚，气道平滑肌增生、肥大，基底膜增厚、玻璃样变等，此种改变称为气道重塑[1]。已有较多的资料显示，转化生长因子-β1(TGF-β1)是哮喘气道重构的主要调控因子，气道管壁增厚、平滑肌增生以及胶原沉积等气道重构的特征与TGF-β1的表达呈正相关[2-3]。本实验以卵蛋白(OVA)、氢氧化铝干粉和灭活百日咳杆菌疫苗致敏大鼠，造成哮喘大鼠模型，将具有宣肺健脾、利气祛痰之功效的哮逐平用于哮喘大鼠的治疗。通过观测支气管-肺组织病理学的改变和TGF-β1的表达，探讨宣肺健脾中药对哮喘气道重塑的影响及其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级雄性Wistar大鼠32只，体重150～180 g，天津市山川红实验动物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(津)2009- 001。
1.2 药物、主要试剂及仪器
哮逐平由天津中医药大学保康医院药房提供，药物基本组成：麻黄、杏仁、桔梗、川贝母、枇杷叶、橘红、茯苓、半夏、厚朴、枳壳、神曲等，水煎，过滤，浓缩至每毫升含原药材2.25 g，密封于无菌量瓶中，4 ℃储存备用。醋酸地塞米松片由天津力生制药股份有限公司生产(批号0708015)，研细末，用蒸馏水配制成浓度为0.187 5 mg/mL混悬液。OVA为美国Sigma公司产品(批号A5253)；灭活百日咳杆菌疫苗由北京天坛生物制品股份有限公司生产(批号200901)；氢氧化铝由天津市化学试剂三厂生产(批号070621)。兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体(产品编号：sc-146)购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。二步法免疫组化检测试剂和浓缩型DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。亚都超声波医用雾化器(型号：YC-Y800B)为北京亚都科技股份有限公司产品。Lecia DM3000自动化正置显微镜图像采集系统由德国Leica Microsystems公司提供。
1.3 动物分组及造模
正常饲养1周后，将大鼠随机分为正常对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、地塞米松组(C组)、哮逐平组(D组)，每组8只。除A组外，其余组哮喘动物模型复制参照文献[4-6]方法进行。每只大鼠于实验第1日和第8日分别腹腔注射抗原液1 mL (含OVA 100 mg、灭活百日咳杆菌疫苗5×109个和氢氧化铝干粉100 mg)，第15日将致敏大鼠置于50 cm×40 cm×30 cm密闭玻璃容器内，给予1% OVA生理盐水悬液超声雾化吸入加以激发，中等雾量，每日1次，每次约20 min，以大鼠出现烦躁不安、呼吸急促、喷嚏或呛咳、轻度紫绀、腹肌抽搐、反应迟钝等表现判定造模成功。A组以等量生理盐水进行致敏和激发，方法同上。造模成功当日开始给药，C、D组分别给予地塞米松0.75 mg/(kg·d)和哮逐平22.5 g/(kg·d)灌胃，给药剂量均为10 mL/kg，A、B组给予等量生理盐水灌胃，均每日1次，共计14 d。其间每日给药后30 min各诱发哮喘1次。
1.4 标本采集
末次雾化激发24 h后，用3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。开胸，取右肺中叶组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋制片，切片厚5 μm。
1.5 指标检测
1.5.1 支气管-肺组织病理学观察 切片行常规苏木精-伊红(HE)染色，观察病理学改变。支气管壁厚度(Wat)和平滑肌厚度(Wam)的检测[7-8]：200倍光学显微镜下挑选3支有完整横断面的中小支气管，采用图像采集系统获取图像，再以专业图像分析软件(Image-Pro Plus 6.0)测量基底膜周径(Pbm)、支气管总面积(Wat1)、管腔面积(Wat2)、平滑肌外缘内气管面积(Wam1)、平滑肌内缘内气管面积(Wam2)，并用Pbm标准化，即分别以(Wat1－Wat2)/Pbm和(Wam1－Wam2)/Pbm来表示Wat(μm2/μm)和Wam(μm2/μm)。
1.5.2 支气管-肺组织转化生长因子-β1含量检测 采用免疫组化PV二步法染色：石蜡切片常规脱蜡、水化，3%h3O2孵育10 min以灭活内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次各2 min，滴加一抗，4 ℃过夜，PBS冲洗3次各2 min，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次各2 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，室温下显色5～20 min，蒸馏水冲洗，苏木精复染5 min，蒸馏水冲洗，1%盐酸酒精分色，自来水冲洗，载玻片蒸干，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察，组织切片中染成棕黄色者为阳性。每张切片于200倍光镜下采集5个具有代表性的互不重叠视野，应用上述图像分析软件测量每个视野的积分光密度(IOD)，以IOD数值大小反映TGF-β1表达的多少。
1.6 统计学方法
所有数据以x±s表示，采用SPSS 11.5统计软件进行处理，组间比较用方差分析，以α＝0.05为检验水准，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠支气管-肺组织病理学改变情况
A组支气管、肺组织无炎性细胞浸润，支气管壁完整，平滑肌厚度正常，细胞排列规整，管腔内无脱落上皮细胞。B组支气管壁及其周围肺组织中有大量以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，黏液腺增生，黏膜皱襞增多，支气管腔内可见黏液栓和炎性细胞，周围组织水肿。支气管平滑肌层明显增厚，排列紊乱，管腔狭窄。C组支气管周围嗜酸性粒细胞及其他炎性细胞浸润减少，气管壁和平滑肌增厚明显减轻，黏膜结构较完整，周围组织水肿较轻，支气管腔内少量脱落细胞。D组支气管黏膜上皮无明显增厚，支气管黏膜规整，管壁及其周围少量炎细胞浸润，管腔内偶见脱落上皮细胞。
2.2 支气管基底膜周径和管壁各层厚度的变化(见表1)表1各组大鼠支气管壁厚度和平滑肌厚度比较(略)注：与A组比较，※P＜0.05，※※P＜0.01；与B组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01
2.3 各组大鼠支气管-肺组织转化生长因子-β1的表达(见表2)表2各组大鼠支气管-肺组织TGF-β1的表达(略)注：与A组比较，※※P＜0.01；与B组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与C组比较，☆☆P＜0.01
3 讨论
大量研究证明，支气管哮喘不仅存在着气道炎症，而且还发生气道结构的改变，即气道重塑。由此可导致气流的不可逆阻塞和持续的气道高反应性，可能是顽固性哮喘的重要病理基础。气道重塑并非只发生在重症哮喘或哮喘病程的晚期，有证据表明，在儿童哮喘的早期就存在气道重塑。TGF-β1是一个能调节多种细胞生长、分化和细胞周围基质环境的多功能细胞因子，存在于气道上皮、黏膜下层和平滑肌层，TGF-β1是哮喘气道重塑过程重要的始动和过程细胞因子[9-11]。哮喘患者支气管黏膜活检标本中TGF-β1表达较健康对照者明显增高。哮喘气道增厚的程度、上皮下成纤维细胞的数量与TGF-β1水平有平行关系。哮喘时巨噬细胞、气道上皮细胞、平滑肌细胞及嗜酸性粒细胞均可大量表达，且TGF-β1的表达与气道基底膜厚度、成纤维细胞数目和(或)哮喘发作的严重程度呈正相关[4，12]。气道重塑是哮喘的一个主要病理学特征，气道重塑一经发生则很难逆转，因此，从促进气道重塑的细胞因子角度去研究干预气道重塑的发生发展，有可能成为防治哮喘的关键环节。
糖皮质激素是治疗哮喘的主要药物，在国际哮喘治疗指南中被推荐使用。实验表明，糖皮质激素类药物有抑制哮喘气道重建的作用，但长期口服或静脉注射导致的不良反应限制了其临床应用，而且临床中常有一些因各种原因不能有效吸入糖皮质激素的患者，因此，寻找和研发阻止哮喘气道重塑的新药，以替代或部分替代糖皮质激素成为一个新的研究方向[13-14]。中医药在防治哮喘方面有着丰富的临床经验和确切的临床疗效，能多途径、多环节、多靶点调整机体的动态平衡，因而受到国内外学者的重视，但多数研究停留在临床观察与症状描述方面，其干预气道重塑的实验研究刚刚起步，对单味中药或中药有效成分作用机制的探讨多于复方[5，15-16]，从中医治则治法角度进行的研究尚未见报道。
支气管哮喘属于中医“哮病”范畴，其病机专主于痰。脾为生痰之源，肺为贮痰之器，哮病的治疗除宣肺化痰、止咳平喘之外，还要健脾祛湿，以绝生痰之源。哮逐平是天津已故名中医何世英主任医师的验方之一，药物组成包括麻黄、杏仁、桔梗、川贝母、枇杷叶、橘红、茯苓、半夏、厚朴、枳壳、神曲等。方中麻黄轻清上浮，专疏肺郁，宣肺平喘。杏仁降肺气，兼疏利开通而宣肺，《本草求真·卷四》谓其“下气除喘”，为治咳喘之要药。《本草求真·卷三》称桔梗“系开提肺气之圣药，可为诸药舟楫，载之上浮”，功在宣肺祛痰，为治肺经病变的要药。川贝母、枇杷叶化痰止咳。半夏为燥湿化痰之要药；厚朴行气、燥湿、消积、平喘，两药并用，辛开苦降，使清者升、浊者降，下肺气、消痰涎而平咳喘。神曲消食化积、健脾和胃。茯苓甘淡性平，归脾、肺经，具有健脾补中、渗湿利水之功，补而不腻，利而不猛，既能扶正，又可祛邪。橘红理气宽中、燥湿化痰。枳壳作用较为缓和，偏走中、上焦，为常用理气药。诸药合用，祛邪不伤正，扶正不留邪，共奏宣肺健脾、利气祛痰之功。
本研究结果显示，哮喘模型组大鼠Wat和Wam明显增加、支气管-肺组织TGF-β1表达水平明显升高，与正常对照组相比，差异有统计学意义，表明TGF-β1参与并促进了哮喘大鼠的气道重塑过程。地塞米松和哮逐平干预均可以减少Wat、Wam和显著降低支气管-肺组织TGF-β1的含量，提示宣肺健脾中药干预哮喘气道重塑的机制可能与抑制支气管-肺组织TGF-β1的过度表达而影响平滑肌增殖、减轻气道壁增厚有关。哮逐平组Wat、Wam和支气管-肺组织TGF-β1减少尤为明显，与地塞米松组相比，差异有统计学意义，其中Wat、Wam与正常对照组相比，差异无统计学意义。宣肺健脾中药对气道重塑进程的调节作用优于地塞米松的具体机制还需深入研究。
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