作者：李杰，伍参荣，陈伶利，李继红，姜晓，陈北阳
【摘要】 目的 探讨定喘汤对哮喘大鼠肺组织及胸腺神经生长因子(NGF)表达的影响。方法 将Wistar大鼠32只随机分为正常对照组、模型组、定喘汤组、必可酮组，每组8只。除正常对照组外，其余各组制备哮喘模型，并分别用药，共15 d。采用免疫组织化学方法，观察大鼠肺和胸腺NGF表达的变化。结果 模型组大鼠NGF在肺组织和胸腺表达明显高于正常对照组，而定喘汤组则明显低于模型组。结论 NGF可能参与哮喘的发病过程，定喘汤抑制哮喘大鼠NGF的表达可能是其治疗哮喘的机制之一。
【关键词】 定喘汤；神经生长因子；肺；胸腺；哮喘；大鼠
Effect of Dingchuantang on Expression of NGF in Lung and Thymus of Asthmatic Rats
LI Jie， WU Can-rong， CHEN Ling-li， et al
Hunan University of TCM， Changsha 410007， China
Abstract：Objective To explore the effect of Dingchuantang on the expression of NGF in the lung and thymus of asthmatic rats. Methods Thirty two Wistar rats were randomly pided into control group， asthmatic group， Dingchuantang group and Beclomethasone group， 8 rats for each group. Asthmatic model was made except the control group. The change of NGF expression in the lung and thymus were observed by means of immunohistochemistry. Results The expression of NGF in the lung and thymus of asthmatic group was much higher than that of control group and that of Dingchuantang group was much lower than that of asthmatic group. Conclusion Over-expression of NGF might be involved in the pathogenesis of bronchial asthma， and inhibition of NGF expression by Dingchuantang may be one of the mechanisms in the treatment of asthma.
Key words：Dingchuantang；nerve growth factor；lung；thymus；asthma；rat
支气管哮喘是一种严重威胁人类健康的慢性呼吸道疾病，近年来其发病率和病死率呈上升趋势。在哮喘发病机制中，免疫细胞与神经元之间存在着广泛的联系，而神经生长因子(NGF)则可能是参与这一免疫神经机制的重要介质。中医药防治本病具有较好的临床疗效，但其治疗机理研究尚不深入。本研究通过观察哮喘大鼠肺组织和胸腺NGF表达及定喘汤对NGF表达的影响，探讨NGF在哮喘发病机制中的作用及定喘汤的平喘机制，为哮喘的治疗提供新的依据。
1 实验材料
1.1 动物
Wistar大鼠32只，雌雄各半，体重120～150 g，清洁级，湖南中医药大学实验动物中心提供。合格证号：SCXK(豫2005-0001)。
1.2 主要试剂
卵清蛋白(OVA)，美国Sigma公司产，北京天象人生物工程公司分装进口；NGF免疫组化试剂盒，武汉博士德生物工程公司提供。
1.3 仪器
超声雾化器为北京亚都YD-800型；多功能酶标仪为华东电子集团公司。
2 实验方法
2.1 分组和造模
按随机原则分为正常对照组、模型组、定喘汤组、必可酮组，每组8只。参照文献[1]方法，腹腔注射1 mL (50 μg)OVA和10 μg氢氧化铝悬液，1周后再注射1次，第4日后用10%OVA雾化吸入(每日1次，每次8～10 min，共12次)，激惹大鼠。正常对照组吸入生理盐水，腹腔注入10 μg氢氧化铝悬液。
2.2 给药与标本采集
定喘汤组从第1次诱喘后每日用定喘汤的水煎液喷雾，每日2次。必可酮组每日用必可酮喷雾，每日2次。正常对照组用生理盐水灌胃。从首次诱喘到治疗结束共15 d，将大鼠用乌拉坦(1 g/kg)肌肉注射麻醉后，常规消毒。沿颈正中线剪开皮肤，切开气管，结扎右支气管，插管，用生理盐水灌洗4次，每次3 mL，回收全部的支气管肺泡灌洗液(BALF)6.5 mL，4 ℃条件下，1 000 r/min离心10 min，去上清液，-70 ℃保存。取胸腺和肺组织保存待用。
2.3 观察指标
2.3.1 支气管肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞计数
采用瑞氏姬姆沙染色，镜下计数200个白细胞数中的嗜酸粒细胞(EOS)，求出百分率，进行统计分析。
2.3.2 肺组织和胸腺神经生长因子的测定
用4%多聚甲醛0.1 mL/mol PBS灌流固定后取下肺组织和胸腺，固定24 h后，移至30%的蔗糖缓冲液中，至标本沉底，OCT包埋，恒冷箱连续切片(片厚16 μm)，冷风干燥后进行免疫组化染色(SABC法)。用图像分析系统对实验结果进行分析，计算光密度值。
3 统计学方法
用SPSS14.0统计软件对数据进行统计分析；多样本均数比较及两两比较分别采用F检验和t检验。
4 结果
(见表1、表2)表1 定喘汤对大鼠BALF中EOS数的影响(略)注：与模型组比较，*P＜0.05(下同)表2 各组大鼠肺组织和胸腺NGF阳性反应产物平均光密度值比较(略)
转贴于5 讨论
支气管哮喘是由肥大细胞、EOS和T细胞等多种炎性细胞及介质作用引起的呼吸系统疾病，其主要特征为慢性气道炎症、气道反应性增高以及间歇性可逆行的气道堵塞。NGF是神经元细胞生长和分化的营养因子，近来发现NGF能影响机体的免疫系统，与变态反应性和炎症性疾病的发病有关[2]。NGF的产生一般由神经系统细胞产生，但在炎症条件下，大量非神经细胞也可产生NGF，包括肥大细胞、EOS、T细胞和B细胞[3]。同时发现NGF能作用于免疫炎性细胞，促进其增殖、分化、存活及介导、促进炎症介质释放，参与炎症反应，加重气道炎症反应[4-5]。
目前研究表明，有变态反应性疾病和哮喘的患者，其血清NGF和BALF中的NGF水平及其受体都增加，并表现出气道高反应性[6]。最近又发现NGF的抗体能够直接抑制支气管的收缩，阻断气道高反应性的发生[7]。因此，可认为NGF是联系气道免疫与神经机制、导致气道高反应性的重要物质。一方面，NGF可通过对气道神经系统的影响，介导气道高反应性；另一方面，NGF也可通过神经源性炎症和“放大”免疫细胞效应参与气道炎症的形成。因此，NGF是连接气道炎症和气道高反应性的一座桥梁。
定喘汤取自《摄生众妙方》，由白果、麻黄、桑白皮、款冬花、半夏、杏仁、苏子、黄芩、甘草组成，药理学证明该方有较好的化痰、平喘、解痉、抑制变态反应作用[8-9]。无论在动物实验还是临床哮喘治疗中都取得了较满意的疗效[10-13]。但定喘汤对哮喘时表达的NGF是否有作用的机制还不够具体，本研究应用SABC法进一步证明了哮喘大鼠肺NGF和胸腺的NGF的mRNA表达明显增多。定喘汤治疗后，上述部位NGF表达明显减弱，并降低BALF中EOS的数量，提示定喘汤可能通过抑制NGF达到消炎平喘效果。由于胸腺是产生T淋巴细胞的主要场所，由此我们可以推断，定喘汤可能通过抑制哮喘大鼠肺和胸腺部位NGF过度表达，调节T细胞亚系TH1/Th3的失衡，从而降低气道炎症反应，抑制哮喘的发生。本研究从NGF方面探讨通过定喘汤防治哮喘的作用机理，为中医药临床进一步治疗哮喘提供新途径和新思路。
【参考文献
】
[1] 伍参荣，刘贵云，李 杰，等.治喘贴对实验豚鼠嗜酸粒细胞凋亡和对白细胞介素-5的影响[J].中华微生物和免疫学杂志，2004，24(7)：549－551.
[2] 夏晓东，徐正桥.神经生长因子与支气管哮喘[J].国外医学·呼吸系统分册，2001，21(4)：205－208.
[3] Freund V， Pons F， Joly V， et a1. Upregulation of nerve growth factor expression by human airway smooth muscle cells in inflammatory conditions[J]. Eur Respir J，2002，20(2)：458－463.
[4] Path G， Braun A， Meents N， et a1. Augmentation of allergic early phase reaction by nerve growth factor[J]. Am J Respir Crit Care Med，2002，166(6)：818－826.
[5] Quarcoo D， Schulte-Herbruggen Q， Lommatzsch M， et a1. Nerve growth factor induces increased airway inflammation via a neuropeptide-dependent mechanism in a transgenic animal model of allergic airway inflammation[J]. Clin Exp Allergy，2004，34(7)：1l46－1151.
[6] Nassenstein C， Braun A， Erpenbeck VJ， et a1. The neurotrophins nerve growth factor， brain-derived neurotrophic factor， neurotrophin-3， and neurotrophin-4 are survival and activation factors for eosinophils in patients with allergic bronchial asthma[J]. J Exp Med，2003，l98(3)：455－467.
[7] De Vries A， Engels F， Henricks PA， et a1. Antibodies directed against nerve growth factor inhibit the acute bronchoconstriction due to allergen challenge in guinea-pigs[J].Clin Exp Allergy，2002， 32(2)：325－328.
[8] 李政木，黎同明.定喘汤治疗支气管哮喘的药理学研究[J].中药材， 1999，(8)：411－413.
[9] 徐长化，孙江桥，李 波，等.定喘汤及其拆方的药理作用[J].中国医院药学杂志，2002，(4)：202－204.
[10] 李顺花.定喘汤对支气管哮喘大鼠总IgE及IL-4的影响[J].中医药学刊，2004，22(11)：121－122.
[11] 肖丽玲，伍参荣.定喘汤对哮喘大鼠NO、ET-1、IL-5的影响[J].中国实验方剂学杂志，2005，11(3)：58－60.
[12] 陈礼华，沈慧琴.定喘汤治疗哮喘63例临床疗效观察[J].甘肃中医， 2007，20(9)：22.
[13] 余月芳，吴国水.定喘汤治疗热哮疗效观察[J].浙江西医结合">中西医结合杂志， 2007，(1)：33－34.