复合酶辅助超声波提取沙枣多糖的工艺分析

　　　　 作者：廉宜君，李炳奇，刘红，马彦梅，陈韩英

【摘要】 目的 研究复合酶辅助超声波提取沙枣多糖的最佳工艺。方法 考察了纤维素酶和果胶酶在不同温度、不同酶量、不同酶作用时间下提取沙枣多糖最佳的方案，并且研究了超声处理对于酶法提取沙枣多糖的影响。结果 沙枣多糖提取的适宜条件是：纤维素酶1.5%、果胶酶1.5%；酶解时间为40 min，酶解温度为55 ℃，超声时间25 min，超声功率400 W，固液比1∶30，超声温度60 ℃。在此条件下，沙枣多糖的提取率可达12.35%。结论 本工艺简单可行，可用于沙枣多糖的提取。

【关键词】 沙枣；多糖；酶；超声波；提取工艺

　　Abstract：Objective To optimize the technological conditions of polysaccharide extraction from Elaeagnus angustifolia L. by enzymatic-assisted ultrasonic. Methods The effects of different enzymes， enzymolysis temperature， enzyme dosage， enzymolysis time， material-water ratio， crushing degree， ultrasonic time and ultrasonic temperature on the extraction rate of Elaeagnus angustifolia L. polysaccharide was analyzed. Results The optimal technological condition was as follows：1.5% cellulase， 1.5% pectic enzyme， enzymolysis time 40 min， enzymolysis temperature 55 ℃， ultrasonic time 25 min， ultrasonic power 400 W， material- water ratio 1∶30， and temperature 60 ℃. In these conditions， the extraction efficiency of polysaccharide was 12.35%. Conclusion The process is simple and practicable， and can be used for the extraction of Elaeagnus angustifolia L. polysaccharide.
　　
　　Key words：Elaeagnus angustifolia L.；
polysaccharides；enzyme；ultrasonic；extraction process

　　沙枣(Elaeagnus angustifolia L.)又名香柳、桂香柳、银柳、七里香等，属胡秃子科落叶小乔木或灌木，在西北各省的干旱沙区广泛栽培。据《新疆中草药手册》记载，沙枣能“强壮，镇静，固精，健胃，止泻，调经，利尿”。维吾尔医多用于脾胃虚弱、消化不良、肠炎腹泻等疾病的治疗[1]。多糖是沙枣的主要组成成分之一[2]。传统的多糖提取方法为水煮醇沉法，温度比较高，提取率较低。近年来，生物酶技术、超声技术在多糖提取工艺中已引起广泛的关注。研究表明，酶能分解大分子粘多糖成可溶性小分子物质；超声波的次级效应如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，有利于有效成分的溶出；生物酶提取和超声提取工艺可以明显降低提取温度、缩短提取时间、提高提取产量、节约溶剂，且对提取物的结构和理化性质无影响。沙枣中多糖的酶结合超声提取工艺目前尚无报道。本试验探讨采用复合酶辅助超声法提取沙枣多糖的工艺条件，为制定经济的沙枣多糖制备工艺提供实验依据。

　　1 仪器与试药
　　
　　旋转蒸发器RE-52AA(上海亚荣生化仪器厂)；KQ-250型超声波提取仪(昆山市超声仪器有限公司)；SartoriusBS210S电子天平(北京塞多利斯天平有限公司)；SHZ-C型循环水式多用真空泵(巩义市英欲予华仪器厂)；722型光栅分光光度计(上海精密科学仪器厂)；电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。沙枣，产地为新疆。纤维素酶(Cellulase，15 U/mg)、果胶酶(pectic enzyme，25 U/mg)，由华美生物工程公司提供。苯酚、浓硫酸、无水乙醇等均为分析纯。

　　2 方法

　　2.1 沙枣多糖的测定

　　测定方法采用苯酚-硫酸法。准确称取标准葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，加水至刻度。分别取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以水补至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，摇匀，静置10 min，室温放置20 min后于490 nm波长处测吸光值(OD)，以2.0 mL水按同样显色作为空白，横坐标为多糖含量(μg)，纵坐标为光密度值，制作标准曲线。提取液准确稀释一定倍数，吸取1.0 mL(相当于10 μg左右的多糖)，按上述步骤操作，测光密度，以标准曲线即可计算样品中多糖含量。然后计算出沙枣多糖提取率。

　　2.2 复合酶辅助超声波提取沙枣多糖的工艺路线

　　去核沙枣→粉碎→水浸→复合酶水解→灭酶→抽滤去杂→超声波处理→离心→旋转蒸发仪浓缩→醇沉→真空干燥→沙枣多糖。

　　2.3 复合酶辅助超声波提取沙枣多糖的操作要点

　　2.3.1 复合酶提取沙枣多糖

　　取去核沙枣于50 ℃鼓风干燥箱干燥24 h，过40目筛，得沙枣渣粉待用。取干燥后的沙枣渣粉与蒸馏水混合，分别在不同条件下进行恒温酶解，根据单因素试验的结果及其他植物多糖提取积累的经验，选取纤维素酶和果胶酶的不同加酶量、酶解时间、酶解温度为考察因素，各取3个水平，进行L9(34)正交试验设计，不考虑各因素间的相互影响。复合酶提取选取的因素水平设计见表1。表1 复合酶提取因素与水平（略）

　　2.3.2 灭酶后超声波提取沙枣多糖

　　以最佳酶解条件反应结束后，升温至85 ℃灭酶，然后进行超声辅助浸提。根据单因素试验结果，多糖提取率主要受超声时间、超声功率、固液比、超声温度4个因素交叉影响。为了全面考虑这4个因素的影响设计了正交试验，选择超声时间、固液比、超声功率、超声温度为考察因素，各取3个水平，进行L9(34)正交试验设计，不考虑各因素间的相互影响。超声波提取选取的因素水平设计见表2。表2 超声波提取因素与水平（略）

　　3 结果与分析

　　3.1 复合酶提取沙枣多糖结果分析

　　(见表3、表4)表3 复合酶提取正交试验结果（略）表4 复合酶提取试验结果方差分析（略）注：F0.05(2，2)＝19.00，F0.01(2，2)＝99.00
　　
　　分析复合酶提取沙枣多糖提取率正交试验结果可以发现，A因素的K2最大，B因素的K3最大，C因素的K2最大，D因素的K3最大，因此，优化工艺条件为A2B3C2D3，即纤维素酶用量1.5%、果胶酶用量1.5%、酶解时间40 min、酶解温度55 ℃。由极差分析结果可以看出，影响多糖粗粉得率的因素主次顺序为A＞C＞B＞D。从表4的方差分析可知：FA＝48.26＞19.00， FB＝4.427＜19.00，FC＝11.67＜19.00。表明纤维素酶的用量对沙枣多糖提取率的影响具有显著影响。

　　3.2 复合酶辅助超声波提取沙枣多糖结果分析

　　(见表5、表6)表5 超声波提取正交试验结果（略）表6 超声波提取试验结果方差分析（略）注：F0.05(2，2)＝19.00，F0.01(2，2)＝99.00
　　　
　　由表5可知，灭酶后超声辅助提取沙枣多糖提取率正交试验结果，D因素影响最大，其次是C因素，再次是A和B因素，即影响沙枣多糖提取率的主次因素为：超声温度＞固液比＞超声时间＞超声功率。D因素即超声温度的最佳水平是60 ℃，C因素即固液比的最佳水平是1∶30，A因素即超声时间的最佳水平是25 min，B因素即超声波功率的最佳水平是400 W。最佳水平组合为A3B3C2D3，即超声波提取沙枣多糖的最佳工艺为：超声时间25 min、超声功率400 W、超声温度60 ℃、固液比1∶30。从表6的方差分析可知：FA＝13.07＜19.00，FC＝21.21＞19.00， FD＝58.86＞19.00。表明超声时间对沙栆多糖提取率无显著影响，而超声温度和固液比对沙枣多糖提取率均有显著影响。

　　3.3 沙枣多糖复合酶辅助超声波提取效果验证

　　将沙枣粉加入纤维素酶1.5%、果胶酶1.5%，在酶解温度60 ℃的条件下提取40 min，　　所得沙枣浸提液85 ℃灭酶，然后进行超声辅助浸提。在超声功率400 W、提取温度60 ℃、固液比1∶30的条件下提取25 min，将提取液真空浓缩，用95%乙醇沉淀，4 000 r/mim离心，干燥，计算多糖提取率。在上述提取条件下，做5组平行试验验证提取效果，测得沙枣多糖平均提取率为12.35%。见表7。表7 多糖提取试验验证结果（略）

　　4 讨论

　　本试验通过正交设计优化了纤维素酶和果胶酶辅助提取沙枣多糖的工艺，并且研究了超声振荡对酶提工艺的影响。结果得到复合酶-超声联合提取沙枣多糖的适宜条件为：纤维素酶1.5%、果胶酶1.5%、酶解温度为55 ℃、酶解时间为40 min，灭酶后超声时间25 min，固液比1∶30，超声功率400 W，超声温度60 ℃。在复合酶-超声联合提取优化条件下提取沙枣多糖的得率较高，比单独用酶降解法(9.06%)提高了36.31%。
　　
　　沙枣中存在的果胶会造成提取液粘度增大，极大影响有效成分的扩散，因此，本试验应用果胶酶来分解果胶。果胶酶能将浸提液中含有的大分子粘多糖分解成可溶性小分子物质，而纤维素酶的添加，可使主要成分是纤维素的植物细胞壁发生不同程度的改变，如软化、膨胀和崩溃等，从而改变细胞壁的通透性，有利于壁内的药效成分溶出。灭酶后用超声波处理，超声波的次级效应如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，有利于有效成分的溶出；从超声提取的角度说，纤维素酶对细胞壁的破坏作用降低了传质阻力，因此，不但提高了产品得率，还缩短了超声提取时间。酶与超声辅助提取具有工艺简单、操作方便等特点，二者结合用于中药有效成分的提取是一种非常好的路线。

参考文献