【摘要】 目的 建立恒古骨伤愈片中橙皮苷含量的检测方法。方法 采用高效液相色谱法，Shim-pack-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.4%磷酸水(20∶80)为流动相，检测波长283 nm。结果 橙皮苷线性范围为0.194～0.970 μg，r＝0.999 9，橙皮苷的平均回收率为98.50%，RSD＝0.63%。结论 该方法用于测定恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量，具有简便、准确、灵敏的特点，可作为该制剂质量控制的指标。
【关键词】 恒古骨伤愈片；橙皮苷；高效液相色谱法；含量测定
Abstract：Objective To determine the content of Hesperidin in Henggu Gushangyu Tablets by high performance liquid chromatography. Methods The determination was conducted on Shim-pack-C18 column (150 mm×4.6 mm， 5 μm) with mobile phase of acetonitrile-0.4% phosphoric acid water (20∶80). The detection wavelength was 283 nm. Results Good linear relationship of Hesperidin between area and amount was noted for 0.194～0.970 μg， with a correlation coefficient of 0.999 9. The average recovery was 98.50%， and RSD was 0.63%. Conclusion The established method is simple， accurate and sensitive， and can be applied to the quality control of the preparation.
Key words：Henggu Gushangyu Tablets；Hesperidin；HPLC；content determination
恒古骨伤愈片是由中成药恒古骨伤愈合剂(收载于《国家中成药标准汇编 骨伤科分册》)改变剂型而制成的新制剂[1]，药味由陈皮、红花、三七等9味中药组成，具有活血益气、补肝肾、接骨续筋、消肿止痛、促进骨折愈合的功效，用于新鲜骨折及陈旧骨折、股骨头坏死、骨关节病、腰椎间盘突出症等。为控制本品的质量，本试验采用高效液相色谱(HPLC)法测定了恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量，作为其内在质量控制指标之一。
1 仪器与试药
日本岛津LC-10 AT高效液相色谱仪；SPD-10A紫外检测器；KQ-250型超声波处理器。
橙皮苷对照品购于中国药品生物制品检定所(批号1107221-200211，HPLC面积归一化法，测定含量为99.99%)；恒古骨伤愈片由吉林万德制药有限公司提供(批号20080401， 20080402，20080403，20080501，20080502，20080503，20080504， 20080505，20080506，2008057)。其他所用化学试剂均为国产AR级。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Shim-pack-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.4%磷酸水(20∶80)；流速：1 mL/min；紫外检测波长：283 nm；理论塔板数按大黄素计算不低于5 000；柱温为室温[2]。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL约含0.05 mg的溶液，即对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取本品20片，研细，取约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声提取(功率180 W、频率60 kHz)30 min，取出，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
按处方量制备不含陈皮药材的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定。结果表明，阴性对照溶液色谱图中与对照品相应位置处无干扰，此法可行(见图1)。
2.5 线性关系考察
精密称取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含橙皮苷0.048 5 mg的对照品溶液。精密吸取对照品溶液4、8、12、16、20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定其峰面积。以峰面积值(A)对进样量(C)进行回归，得到回归方程为：Y＝1 008 770.377X＋25 623.859，r＝0.999 9，结果表明，橙皮苷在0.194～0.970 μg范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验
精密吸取供试品溶液连续5次重复进样，测得橙皮苷峰面积RSD＝0.57%。
2.7 稳定性试验
精密吸取供试品溶液在0、2、4、6 h分别进样，进行测定。结果橙皮苷峰面积RSD＝0.47%，表明在6 h内供试品溶液中橙皮苷含量稳定。
2.8 重复性试验
精密称取同一批号样品5份，按供试品溶液的制备方法制备，依法进样分析，结果样品中橙皮苷含量RSD＝0.50%，表明其重复性良好。
2.9 加样回收率试验
精密称取橙皮苷对照品适量，加入到已测知橙皮苷含量的恒古骨伤愈片样品(批号20080401，橙皮苷含量3.081 5 mg/g)中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声提取30 min，取出，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，制得供试品溶液，进样5 μL，测定并计算回收率。结果平均回收率为98.5%，RSD＝0.63%。见表1。表1 加样回收率试验结果（略）
2.10 样品测定
按上述方法，制备供试品溶液，测定10批恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量。测定结果表明，恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量基本稳定，暂定为每片含橙偿皮苷含量不得少于1.40 mg。结果见表2。表2 恒古骨伤愈片中橙皮苷含量测定结果（略）
3 讨论
有关橙皮苷的HPLC含量测定方法较多，流动相采用乙腈、甲醇、水、冰醋酸等系统[3-4]。我们通过摸索，采用乙腈、磷酸水系统，色谱分离效果较为满意，分离度及峰形对称性较好。
待测成分橙皮苷易溶于甲醇，故采用甲醇溶剂提取。对供试品提取方法的考察采用加热回流提取和超声提取，测定结果分别为3.812、3.810 mg/g，两种方法制得的供试品中橙皮苷含量无差异，均可使橙皮苷提取完全。为了简化操作，故选用超声提取制备供试品溶液。本试验对超声提取时间进行了考察，分别以20、30、40 min进行超声提取，测定结果分别为3.652、3.811、3.813 mg/g，超声提取30 min以上，可使橙皮苷充分浸出，为了缩短检测时间，故确定超声提取时间为30 min。
【参考文献】
[1] 国家食品药品监督管理局.国家中成药标准汇编 骨伤科分册[S].2002.320.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社，2005.132.
[3] 张立峰，赵国强，刘灿仿，等.高效液相色谱法测定康儿灵颗粒中橙皮苷的含量[J].西北药学杂志，2008，23(2)：70.
[4] 王举涛，陈 明，刘丛彬，等.HPLC测定养胃舒软胶囊中橙皮苷的含量[J].中成药，2008，30(2)：309.