作者：谢朝晖，李岩，严宛鸿，王春爱，周骁
【摘要】 目的 观察参附注射液对大鼠肢体缺血再灌注后骨骼肌组织髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)含量和细胞色素氧化酶(CCO)及钙激活ATP酶(Ca2＋-ATPase)活性水平变化的影响，探讨其作用机制。方法 SD大鼠30只，建立肢体缺血再灌注损伤模型。A组：对照组(10只)，只做手术，不做阻断；B组：缺血再灌注组(10只)，缺血4 h，再灌注4 h，未作药物治疗；C组：参附注射液治疗组(10只)，缺血及再灌注时间同前一组。阻断前于股动脉阻断部位处注入参附注射液(2.0 mL/kg)，5 min后夹闭股动静脉。再灌注前15 min，再次自尾静脉注入同样浓度参附注射液，检测骨骼肌组织MPO、MDA、湿重/干重值(W/D)和CCO及Ca2＋-ATPase活性的变化。结果 参附注射液能降低大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤所引起的骨骼肌组织MPO、MDA、W/D的升高，在一定程度上保护CCO及Ca2＋-ATPase的活性。结论 参附注射液可减轻肢体缺血再灌注时骨骼肌组织的损伤。
【关键词】 骨骼肌；再灌注损伤；参附注射液；大鼠
Abstract：Objective To observe the effect of shenfu injection on ischemia/reperfusion injury in skeletal muscle of rats. Methods Rat posterior limb ischemia/reperfusion model were made. Thirty SD rats were randomly pided into three groups (n＝10)：sham group (group A)， ischemia/reperfusion group (group B) and shenfu injection treatment group(group C). In group A， the rats received sham operation only. In group B， the animals recieved posterior limb ischemia 4 hours and reperfusion 4 hours. In group C， shenfu injection 2.0 mL/kg were injected iv 5 min before ischemia and 15 min before reperfusion. The level of malondialdehyde (MDA)， myeloperoxidase (MPO)， wet weight/dry weight (W/D)， cytochrome oxidase (CCO) and Ca2+-ATPase in the skeletal muscle were measured at the end of the experiment. Results Shenfu injection can reduce the heightened level of MDA， MPO， W/D and protect the activity of CCO， Ca2+-ATPase in the skeletal muscle， lighten the injury of the ultrastructure. Conclusion Shenfu Injection can protect ischemia/reperfusion injury in skeletal muscle.
Key words：skeletal muscle；ischemia/reperfusion injury；Shenfu injection；rat
临床上急性动脉栓塞、血栓形成、外伤、手术时捆扎止血带以及血管重建手术时的血流阻断，均可引起肢体不同程度的缺血再灌注损伤。肢体缺血再灌注损伤及其保护是关系到肢体功能恢复的重要问题。本研究旨在探讨参附注射液对肢体缺血再灌注损伤的保护作用及其作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠30只，体重250～300 g，甘肃中医学院实验动物中心提供。
1.2 试剂与药物
髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供。参附注射液系医用注射液，雅安三九药业有限公司产品，批准文号：国药准字Z51020664，批号041106。
2 实验方法
2.1 造模
2%戊巴比妥钠(首次40 mg/kg体重，维持量20 mg/kg体重)腹腔注射麻醉后，参照Crinnion[1]法建立大鼠后肢骨骼肌缺血再灌注损伤模型。
2.2 分组
实验前12 h禁食，自由饮水，随机分为3组。A组(对照组)10只，仅麻醉及颈外静脉插管术；B组(缺血再灌注治疗组)10只，缺血4 h后放开止血带，再灌注4 h；C组(参附注射液治疗组)10只，再灌注前15 min自颈外静脉给参附注射液5 mg/kg；而B组仅给予等量的生理盐水作为对照。再灌注4 h即颈动脉放血处死动物，于后肢腓肠肌取材。
2.3 观测指标及方法
MDA、MPO检测严格按试剂盒要求进行。湿重/干重(W/D)测定：取腓肠肌200 mg立即测其湿重，然后于80 ℃恒温干燥箱中干燥48 h，再测干重，最后计算W/D，以反映组织水肿程度。另取材按酶组织化学常规制作标本并分别进行细胞色素氧化酶(CCO)及钙激活ATP酶(Ca2+-ATPase)组织化学染色和活性观察，CCO按DAB法，Ca2+-ATPase按Chayen法[2]。标本切成1 mm×1 mm×1 mm大小，用3%戊二醛固定，Epon包埋，醋酸铀和枸椽酸铅双重染色，所有反应根据切片着色深浅在10×40倍光镜下定性。用阴性(－，不着色)、弱阳性(±，介于阴性和阳性之间，稍着色，但不足以达到阳性水平)、阳性(＋，Ca2＋-ATPase为淡棕色，CCO为淡茶褐色)、中等阳性(＋＋，Ca2＋-ATPase为棕色，CCO为茶褐色)、强阳性(＋＋＋， Ca2+-ATPase为深棕色，CCO为黑褐色)表示组织化学反应的强弱。在光镜下每张切片随机取10个高倍视野进行定性观察。
2.4 统计学方法
数据以x±s表示，组间比较用t检验。定性结果按95%定性级分析不同组。
3 结果
3.1 髓过氧化物酶、丙二醛及湿重/干重检测
(见表1)表1 骨骼肌组织MPO、MDA、W/D及酶组织化学变化(略)注：与A组比较，**P&<0.01；与B组比较，△P&<0.05，△△P&<0.01。
B组反映中性粒细胞游走并在组织内聚集的MPO活性及反映微血管通透性的W/D明显升高(P&<0.01)；而C组两项指标则明显低于B组(均P&<0.05)。本实验还观察到组织脂质过氧化产物MDA在B组中明显高于A组(P&<0.01)。
3.2 对细胞色素氧化酶的影响
正常骨骼肌细胞此酶呈中等阳性至强阳性(＋＋～＋＋＋)，
B组此酶活性降至阳性(＋)，C组此酶为中等阳性(＋＋)，明显强于缺血再灌注组。
3.3 对钙激活ATP酶活性的影响
正常骨骼肌细胞此酶活性为阳性至中等阳性(＋～＋＋)。
B组此酶活性为弱阳性(±)，C组此酶活性为阳性(＋)，强于B组。
4 讨论
肢体结构中对缺血最敏感的是骨骼肌，缺血4～6 h就可发生不可逆性损伤。Beyersderf等[3]研究证明，骨骼肌在较长的缺血时间内仍能保持完整结构，但在恢复正常血流即再灌注时，能量耗竭的肌细胞则发生了损伤性改变。本实验观察到，骨骼肌缺血再灌注后组织水肿明显，肌肉组织中性粒细胞浸润增加。再灌注前用参附注射液，减轻了再灌注过程中组织水肿，并缓解了中性粒细胞浸润等缺血再灌注时的损伤性表现。
骨骼肌缺血再灌注期间，黄嘌呤氧化和白细胞的呼吸爆发产生大量的自由基，直接造成组织的脂质过氧化、蛋白质变性及酶活性降低，是骨骼肌再灌注损伤的重要病理因素之一。MDA是氧自由基致脂质过氧化的中间代谢产物，可间接反映体内氧自由基产生量的变化。本研究中缺血再灌注损伤组在再灌注后组织MDA增加，参附注射液组MDA和缺血再灌注组相比明显减少，表明参附注射液具有清除氧自由基的作用，使骨骼肌细胞免受氧自由基的损伤。细胞内低浓度钙是维持细胞正常生理功能的保证。骨骼肌缺血再灌注后细胞内钙离子大量蓄积，出现“钙超载”现象，这种钙超负荷可导致细胞功能降低，加重缺血后肌肉崩解。骨骼肌缺血再灌注时ATP生成减少，使细胞Na+-Ca2+交换增加，再灌注后由于恢复了能量供应和ATP值，从而促进Na+-Ca2+交换，使细胞外钙大量内流，造成细胞内钙超载。参附注射液能对抗氧自由基对基质网Ca2+-ATP酶活性的抑制，且分子结构与各钙调素拮抗剂类似，具有显著的钙拮抗作用[4-5]，有助于减轻钙超载引起的损伤。参附注射液可抑制TXA2的生成，使血管扩张，降低外周血管阻力，改善骨骼肌再灌注导致的微循功能障碍。此外，参附注射液还可抑制血小板和白细胞的集聚[6]。CCO位于线粒体内膜，与富含磷脂的线粒体膜结构紧密结合，形成不溶性的脂蛋白，该酶与氧化磷酸化系统相偶联而进行ATP的合成，其活性的高低亦可反映体内能量代谢的强弱。本实验研究发现，再灌注4 h时，骨骼肌细胞CCO、Ca2+-ATPase活性下降，说明由于肌细胞缺氧、膜性结构的破坏导致三羧酸循环水平的降低，线粒体氧化磷酸化过程亦受到抑制。位于肌球蛋白头部即功能端的Ca2+-ATPase随着膜性结构的破坏以及胞内ATP的减少，该酶活性呈下降趋势，明显低于对照组的同种酶活性。这说明尽管恢复了有氧灌注，但由于大量氧自由基释放和钙返流进一步破坏了骨骼肌细胞的结构和功能。
参考文献
[1] Crinnion JN， Homer VS， Parkin SM， et al. Role of neutrphil- endothelial adhesion in skeletal muscle reperfusion injury[J]. Br J Surg，1996，83(2)：251.
[2] 朱逢春主译.新酶组织化学[M].北京：人民卫生出版社，1983.112－118.
[3] Beyersderf F， Unger A， Wildhirt， et al. Studies of reperfusion injury in skeletalmuscle：preserved cellular viability after extended period of warm ischemia[J].Cardiovasc Surg，1991，32：664.
[4] Fujimura H， Kambyshi JI， Mondem M， et al. Coagulation factor v Leiden mutation may have a racial background[J].Thrombosis and Haemostasis，1995，74：1381.
[5] 储海燕，诸 江，王鸿利，等.上海地区深静脉血栓形成患者抗活化的蛋白C及FvLeiden突变的初步调查[J].中华血液学杂志，1996，17(9)：462.
[6] Xiu R J， Ham merschmidt DE， Coppo PA， et al. Andisodamine inhibits thromboxane synthesis， granulocyte aggregation and platelet aggregation[J].JAMA，1982，247(10)：1458.