作者：钱会南，王乐，胡雪琴，沈丽波
【摘要】 目的 比较健脾与补肾对脾虚模型大鼠脑内生长抑素(SS)水平和受体基因表达的影响。方法 采用苦降泻下、饮食失节加劳倦过度法建立脾虚大鼠模型，以免疫组化和原位杂交法检测下丘脑腹侧核、海马CA1区、前额叶皮层SS及生长抑素受体1(SSR1)mRNA基因表达变化。结果 模型组上述脑区SS免疫阳性反应物及SSR1 mRNA表达阳性反应物明显降低，与正常组比较差异显著；健脾组与补肾组上述脑区的SS免疫阳性反应物及SSR1 mRNA表达阳性反应物明显升高，与模型组比较差异显著，与正常组比较无显著差异。结论 脾虚模型大鼠脑内对学习记忆有促进作用的SS水平和SSR1 mRNA基因表达有变化，健脾与补肾可能通过调节SS水平和SSR1基因表达而影响学习记忆能力。
【关键词】 脾虚模型；生长抑素；生长抑素受体1 mRNA基因表达；大鼠
Abstract：Objective To compare on the influence of invigorating spleen and restoring virility to the SS level and SSR1 gene expression in brain. Method The spleen insufficiency model of rat was established by adopting bitter decline diarrhea， wild eating and overworking. SS level and SSR1 gene expression change of hypothalamus ventral kernel， hippocampi CA1 area and forehead corte were detected by immunohistochemistry and in situ hybridization techniques. Result In the model group， the immunoreaction masculine substance of SS and SSR1 mRNA， hypothalamus ventral kernel， hippocampi CA1 area and forehead cortex decreased obviously. The immunoreaction masculine substance of SS and SSR1 mRNA on above mentioned parts in the group of invigorating spleen and restoring virility increased distinctly. Conclusion In the model group， the SS level and SSR1 gene expression in brain to promoting study memory ability changed. Invigorating spleen and restoring virility may affect study memory ability by regulating the SS level and SSR1 gene expression.
Key words：invigorating spleen and restoring virility；SS；SSR1 mRNA gene expression；rat
脾与肾在神志活动中具有重要作用，而且脾与肾先天与后天相互资生、相互促进。本研究从检测脾虚模型大鼠脑内与学习记忆相关的生长抑素(SS)水平和生长抑素受体1(SSR1)mRNA基因表达变化及健脾与补肾的干预影响，探讨脾藏意、肾藏志理论。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级雄性Wistar大鼠，体重(160±10)g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
1.2 主要仪器
OLYMPUS光学显微镜(日本)；OLYMPUS自动显微镜照相系统(日本)；DH3600AB电热恒温培养箱(天津)；TS-100脱色摇床(北京)；BDS1电热三用水浴箱(北京)；DHG9075A电热恒温鼓风干燥箱(上海)；Leitz切片机(德国)。
1.3 主要试剂
SS(1抗多克隆兔抗)，上海第二军医大学神经解剖教研室提供；正常羊血清、h3O2、2抗(生物素标记的IgG)、3抗(ABC复合物)、PBS、枸橼酸钠、3-3二氨基联苯胺(DAB)均购自北京中山生物公司。SS原位杂交试剂盒(包括杂交液、地高辛标记的SSR1 cRNA探针、BCIP/NBT显色剂等)，上海第二军医大学神经解剖教研室提供。Anti-Digoxigenin-AP(Roche公司)；牛血清蛋白冻干粉、蛋白酶K、DEPC为美国Sigma公司产品；tritonX-100、甘氨酸、多聚甲醛、Tris、EDTA购于北京鼎国生物公司。其它试剂均为国产分析纯。
2 实验方法
2.1 实验药物配制
造模药物由大黄、厚朴、枳实组成，按2∶1∶1配备。健脾方为归脾汤原方；补肾方为六味地黄丸原方。药材由金象大药房提供。以上方药分别常规煎煮、过滤，常规浓缩为1 g/mL药液，冰箱储存备用。
2.2 动物分组与处理
常规适应性饲养1周后，40只大鼠随机分成正常组、模型组、健脾组、补肾组，每组10只。
采用苦降泻下、饮食失节加劳倦过度法造模[1]。造模组每日灌胃造模药7.5 g/kg，隔日禁食，自由饮水，每日于25 ℃水中游泳至力竭。健脾组造模处理加胃饲归脾汤，每日7.5 g/kg；补肾组造模处理加胃饲六味地黄丸，每日7.5 g/kg。上午对除正常组外的3个组胃饲造模药，正常组予等量生理盐水；下午健脾组、补肾组分别胃饲相应中药，并观察大鼠活动状态、排便、进食量、体重等。连续处理6周。
2.3 标本的采集与制备
大鼠经10%水合氯醛(0.4 mL/100 g体重)麻醉后，立即打开胸腔，暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，首先灌注预冷的生理盐水，然后灌注预冷的4%多聚甲醛溶液；取脑，用蒸馏水漂洗后，置4%多聚甲醛溶液中固定45 min；常规石蜡包埋。石蜡切片机冠状连续切片，片厚6 μm，常温保存备用。
2.4 生长抑素免疫组化方法
免疫组化按照SS及SSR1检测试剂盒使用说明操作。
2.5 生长抑素原位杂交方法
试验用品用DEPC浸泡，经高温高压灭菌；试剂用高温高压灭菌的DEPC水配制，保证无RNA酶污染。原位杂交按照SS及SSR1检测试剂盒使用说明操作。
2.6 光镜观察及图像处理
利用Olympus显微镜和真彩色病理图像分析系统4.0版进行图像采集和处理，测量海马CA1区、前额叶皮层、下丘脑腹内侧核SS免疫阳性反应物和SSR1 mRNA阳性反应物的平均光密度。每组切片的每个部位测5个视野。
2.7 统计学方法
结果均采用SPSS10.0统计软件分析，数据用x±s表示，组间差异采用方差分析(ANOVA)。
3 结果
3.1 各组大鼠海马CA1区、下丘脑腹侧核、前额叶皮层SS免疫组化检测
在光镜下SS免疫阳性反应物呈棕黄色，在海马、皮层、下丘脑均有分布。正常组显色较深，呈强阳性，界限明显；模型组显色淡，界限不清，在海马CA1区、前额叶皮层和下丘脑腹侧核SS免疫阳性反应物平均光密度较低；而健脾组显色均匀，界限明显，在海马CA1区、前额叶皮层和下丘脑腹侧核SS免疫阳性反应物平均光密度较高；补肾组SS免疫阳性反应物平均光密度较高。结果见表1。表1 各组大鼠脑内SS免疫阳性反应物平均光密度比较(略)注：与正常组比较，*P&<0.05，**P&<0.01；与模型组比较，#P&<0.05，##P&<0.01(下同)。
3.2 各组大鼠海马CA1区、下丘脑腹侧核、前额叶皮层SSR1 mRNA表达
(见表2)表2 各组大鼠脑内SSR1 mRNA表达阳性反应物平均光密度比较(略)
4 讨论
苦降泻下、饮食失节加劳倦过度法是较有代表性的造模要素，本实验采用制备大鼠脾虚模型的方法属于多因素造模，是目前应用较广泛的脾虚模型。参照大鼠脾气虚证模型评估标准[2-4]，结合本研究模型组状态和体征变化，成功建立脾虚模型。
归脾汤具有健脾养心、益气补血之功。《名医方论》解释说：“夫心藏神，其用为思；脾藏智，其出为意。是神智思意，火土合德者也。心以经营之久而伤，脾以意虑之郁而伤，则母病必传诸子，子又能令母虑，所以然也。其症则怔仲，怵惕烦躁之征见于心；饮食倦怠，不能运思，手足无力，耳目昏瞀之征见于脾。故脾阳苟不运，心肾必不交……而心阴何所赖以养，此取坎填离者，所以必归之于脾也。”可见，归脾汤具有益气补血、健脾养心之功，但以健脾为主，在治疗由脾虚引起的健忘、失眠、怔仲等神志疾病时多使用归脾汤。六味地黄丸为滋补肾阴之基础方[4]，近来研究表明，六味地黄汤可改善快速老化模型小鼠学习记忆能力，并显著降低该模型血浆皮质酮水平[5-6]。
本研究发现，脾虚模型组大鼠海马CA1区、前额叶皮层和下丘脑腹侧核的SS免疫阳性反应物及SSR1 mRNA表达阳性反应物显著下降，与正常组比较差异极显著；健脾组与补肾组上述脑区的SS免疫阳性反应物及SSR1 mRNA表达阳性反应物明显升高，与模型组比较差异极显著，与正常组比较无显著差异。提示归脾汤对脾虚大鼠学习记忆能力的改善机理与其对脑内SS水平及SSR1基因表达的影响有关。推测六味地黄丸改善学习记忆的作用可能与归脾汤有相似之处。
参考文献
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