作者：吕秀芳，孟庆宇，郭新民
【摘要】 目的 从基因水平研究白花蛇舌草对体外培养的人肝癌Bel7402细胞诱导凋亡的作用及其可能的作用机制。方法 采用人肝癌Bel7402细胞常规体外培养，随机设定空白对照组、5-氟尿嘧啶(5-Fu)阳性对照组、白花蛇舌草组。倒置显微镜直接观察细胞形态变化。HE染色法光镜下观察细胞形态改变，计算凋亡指数。采用MTT法检测白花蛇舌草对癌细胞的生长抑制作用。RT-PCR半定量法检测Bcl-xl、p53基因mRNA表达的变化。结果 光镜下观察到白花蛇舌草组肿瘤细胞脱壁，有细胞出芽现象等凋亡形态改变；凋亡指数略低于5-Fu阳性对照组，但与空白对照组比较有显著差异(P&<0.01)；细胞抑制率略低于5-Fu阳性对照组，与空白对照组相比有显著差异(P&<0.01)；上调p53基因mRNA表达，降低Bcl-xl基因mRNA表达，与空白对照组比较均有显著差异。结论 白花蛇舌草抑制人肝癌Bel7402细胞增长，诱导细胞凋亡，其分子机制可能与激活抑癌基因p53基因、抑制原癌基因Bcl-xl基因表达有关。
【关键词】 白花蛇舌草；人肝癌Bel7402细胞；细胞凋亡；Bcl-xl基因；p53基因
Abstract：Objective To study the inducing apoptosis of Hedyotis diffusa extract (HDE) on human hepatocarcinoma cell line Bel7402 and its molecular mechanism. Methods Human hepatocarcinoma cell line Bel7402 was used in vitro cell culture， there were 3 groups：control group， HDE group and 5-Fu group， the Bel7402 cells were dealed with them respectively. The apoptosis morphologic changes of human hepatocarcinoma cells were observed by invert microscope. The apoptosis rate was detected with hematoxylin stain by light microscope. Inhibition of Bel7402 cell proliferation was measured by MTT assay. The expression of oncogene Bcl-xl and anti-oncogene p53 of Bel7402 ceils were observed with RT-PCR assay. Results Compared with the control group， the condensation of nuclear， vacuolar degeneration of mitochondria could be found through light microscope. The apoptosis rate of HDE group was remarkably increased compared with that in control group (P&<0.01). The inhibition of HDE group was remarkably increase compared with that in control group (P&<0.01). The expression of the gene p53 raised and Bcl-xl decreased. Conclusion HDP can induce tumor cells apoptosis， the activation of p53 and the suppression of Bcl-xl may contribute to the apoptosis mechanism.
Key words：Hedyotis diffusa extract；Bel7402；apoptosis；Bcl-xl；p53
白花蛇舌草(Hedyotis diffusa willd)为茜草科植物白花蛇舌草的全草，具有清热利湿、解毒抗癌之功效。白花蛇舌草含有的许多化学成分对各类癌症有抑制作用，且富含具抗癌作用的微量元素钛等[1]。但目前对白花蛇舌草各种成分抗肿瘤的作用机制尚不十分清楚，且对基因表达方面的研究尚未见报道。本研究的目的在于观察白花蛇舌草对人肝癌Bel7402细胞是否具有凋亡诱导作用，初步探讨其作用机制。
1 实验材料
人肝癌Bel7402细胞株，武汉中美科技有限公司提供。白花蛇舌草，牡丹江医学院红旗医院药房提供。5-氟尿嘧啶(5-Fu)，牡丹江医学院红旗医院药房提供。RPMI-1640为Gibco公司产品。引物核苷酸片段：上海生物工程技术有限公司合成。Bcl-xl引物：上游5’-CCCAGAAAG GATACAGCTGG-3’，下游5’-GCGATCCGACTCACCAATAC-3’，扩增片段448 bp。p53引物：上游5’-ACATGGAGGCCAACAAGAAC-3’，下游5’-CTTCTCCAGGTTT GCTCTGG-3’，扩增片段115 bp。β-actin：上游5’-CTGACTGACTA CCTCATGAAGATC-3’，下游5’-GGAAGGAA GGCTGGAAGAGTG-3’(248 bp)。超纯水净化器；超低温冰箱、CO2培养箱；光学显微镜；超净工作台，高速低温离心机；酶标仪；PCR仪；电泳槽。
2 实验方法
2.1 药物制备
白花蛇舌草90 g，500 mL水浸泡 60 min，加热沸腾60 min，
120目网筛过滤弃药渣，滤液12 000 r/min离心20 min 2次，取上清液，浓缩至90 mL，0.22 μm滤膜过滤除菌，获1.0 g/mL白花蛇舌草提取液，浓缩成100 mg/mL白花蛇舌草提取物溶液。
2.2 细胞形态学观察
人肝癌Bel7402细胞株常规培养于含10%灭活胎牛血清RPMI-1640培养液中，传代后培养48～72 h的贴壁细胞为对数生长期细胞用于实验。消化、搜集对数生长期的细胞，将细胞密度调整至2×107/mL，吸取100 μL细胞接种于有盖玻片的96孔板，培养箱孵育24 h以让细胞贴壁。吸出培养液，分为空白对照组、5-Fu对照组、100 mg/mL白花蛇舌草组3组，每组6孔。培养箱孵育48 h。直接观察细胞形态变化。经漂洗、固定后进行HE染色，观察细胞形态变化，计数100个细胞。凋亡指数＝凋亡细胞数/计数细胞总数×100%。x
【摘要】 目的 从基因水平研究白花蛇舌草对体外培养的人肝癌Bel7402细胞诱导凋亡的作用及其可能的作用机制。方法 采用人肝癌Bel7402细胞常规体外培养，随机设定空白对照组、5-氟尿嘧啶(5-Fu)阳性对照组、白花蛇舌草组。倒置显微镜直接观察细胞形态变化。HE染色法光镜下观察细胞形态改变，计算凋亡指数。采用MTT法检测白花蛇舌草对癌细胞的生长抑制作用。RT-PCR半定量法检测Bcl-xl、p53基因mRNA表达的变化。结果 光镜下观察到白花蛇舌草组肿瘤细胞脱壁，有细胞出芽现象等凋亡形态改变；凋亡指数略低于5-Fu阳性对照组，但与空白对照组比较有显著差异(P&<0.01)；细胞抑制率略低于5-Fu阳性对照组，与空白对照组相比有显著差异(P&<0.01)；上调p53基因mRNA表达，降低Bcl-xl基因mRNA表达，与空白对照组比较均有显著差异。结论 白花蛇舌草抑制人肝癌Bel7402细胞增长，诱导细胞凋亡，其分子机制可能与激活抑癌基因p53基因、抑制原癌基因Bcl-xl基因表达有关。
【关键词】 白花蛇舌草；人肝癌Bel7402细胞；细胞凋亡；Bcl-xl基因；p53基因
Effect of Hedyotis Diffusa Extract on Apoptosis of Human Hepatocarcinoma Cell Line Bel7402
LU Xiu-fang， MENG Qing-yu， GUO Xin-min
Biochemistry and Molecular biology Section of Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China
Abstract：Objective To study the inducing apoptosis of Hedyotis diffusa extract (HDE) on human hepatocarcinoma cell line Bel7402 and its molecular mechanism. Methods Human hepatocarcinoma cell line Bel7402 was used in vitro cell culture， there were 3 groups：control group， HDE group and 5-Fu group， the Bel7402 cells were dealed with them respectively. The apoptosis morphologic changes of human hepatocarcinoma cells were observed by invert microscope. The apoptosis rate was detected with hematoxylin stain by light microscope. Inhibition of Bel7402 cell proliferation was measured by MTT assay. The expression of oncogene Bcl-xl and anti-oncogene p53 of Bel7402 ceils were observed with RT-PCR assay. Results Compared with the control group， the condensation of nuclear， vacuolar degeneration of mitochondria could be found through light microscope. The apoptosis rate of HDE group was remarkably increased compared with that in control group (P&<0.01). The inhibition of HDE group was remarkably increase compared with that in control group (P&<0.01). The expression of the gene p53 raised and Bcl-xl decreased. Conclusion HDP can induce tumor cells apoptosis， the activation of p53 and the suppression of Bcl-xl may contribute to the apoptosis mechanism.
Key words：Hedyotis diffusa extract；Bel7402；apoptosis；Bcl-xl；p53
白花蛇舌草(Hedyotis diffusa willd)为茜草科植物白花蛇舌草的全草，具有清热利湿、解毒抗癌之功效。白花蛇舌草含有的许多化学成分对各类癌症有抑制作用，且富含具抗癌作用的微量元素钛等[1]。但目前对白花蛇舌草各种成分抗肿瘤的作用机制尚不十分清楚，且对基因表达方面的研究尚未见报道。本研究的目的在于观察白花蛇舌草对人肝癌Bel7402细胞是否具有凋亡诱导作用，初步探讨其作用机制。
1 实验材料
人肝癌Bel7402细胞株，武汉中美科技有限公司提供。白花蛇舌草，牡丹江医学院红旗医院药房提供。5-氟尿嘧啶(5-Fu)，牡丹江医学院红旗医院药房提供。RPMI-1640为Gibco公司产品。引物核苷酸片段：上海生物工程技术有限公司合成。Bcl-xl引物：上游5’-CCCAGAAAG GATACAGCTGG-3’，下游5’-GCGATCCGACTCACCAATAC-3’，扩增片段448 bp。p53引物：上游5’-ACATGGAGGCCAACAAGAAC-3’，下游5’-CTTCTCCAGGTTT GCTCTGG-3’，扩增片段115 bp。β-actin：上游5’-CTGACTGACTA CCTCATGAAGATC-3’，下游5’-GGAAGGAA GGCTGGAAGAGTG-3’(248 bp)。超纯水净化器；超低温冰箱、CO2培养箱；光学显微镜；超净工作台，高速低温离心机；酶标仪；PCR仪；电泳槽。
2 实验方法
2.1 药物制备
白花蛇舌草90 g，500 mL水浸泡 60 min，加热沸腾60 min，
120目网筛过滤弃药渣，滤液12 000 r/min离心20 min 2次，取上清液，浓缩至90 mL，0.22 μm滤膜过滤除菌，获1.0 g/mL白花蛇舌草提取液，浓缩成100 mg/mL白花蛇舌草提取物溶液。
2.2 细胞形态学观察
人肝癌Bel7402细胞株常规培养于含10%灭活胎牛血清RPMI-1640培养液中，传代后培养48～72 h的贴壁细胞为对数生长期细胞用于实验。消化、搜集对数生长期的细胞，将细胞密度调整至2×107/mL，吸取100 μL细胞接种于有盖玻片的96孔板，培养箱孵育24 h以让细胞贴壁。吸出培养液，分为空白对照组、5-Fu对照组、100 mg/mL白花蛇舌草组3组，每组6孔。培养箱孵育48 h。直接观察细胞形态变化。经漂洗、固定后进行HE染色，观察细胞形态变化，计数100个细胞。凋亡指数＝凋亡细胞数/计数细胞总数×100%。
2.3 生长抑制率测定
将上述方法培养的细胞加入2O μL 5.0 g/L的四甲基偶氮唑盐溶液继续培养4 h，吸净培养液后每孔加100 μL DMSO，振荡10 min，在酶标仪上测492 nm吸光度值，按细胞抑制率＝(1－实验组吸光度/对照组吸光度)×100%公式，计算各组抑制率。
2.4 半定量反转录聚合酶链反应测定Bcl-xl、p53表达
2.4.1 总RNA抽提
收集上述各组细胞1×107个于离心管中，加1 mL Trizol，提取总RNA。紫外分光光度仪测吸光度值(A260，A280)，RNA浓度(g/L)＝A260×l2.5，纯度要求A260&>A280&>1.8，经l%甲醛琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，28 S/18 S＝2。-70 ℃保存。
2.4.2 逆转录反应合成cDNA
按试剂盒程序操作，引物选择Oligo dT-Adaptor Primer。依次加入MgCl2、5×RNA PCR Buffer、Rnase Free dh3O、dNTP Mixture、Rnase Inhibitor、MMLV Reverse Transcriptase、Oligo dT-Adaptor Primer、实验样品RNA。上述试剂混匀，移入PCR仪，按30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，一个循环进行逆转录反应合成cDNA。
2.4.3 聚合酶链反应
在上述反应体系添加：10xBufer；MgCl2(25 mmol/L)；引物P1、P2、P3、P4(0.25 μmol/L)；Taq酶1 μL(2.5 μ)；dd h30。置聚合酶链反应分别扩增。Bcl-xl反应条件：先94 ℃预变性5 min；然后进行扩增循环，包括变性30 s(94 ℃)，退火30 s(58 ℃)，延伸1 min(72 ℃)，共3O个循环，最后72 ℃延伸7 min。p53反应条件：先94 ℃预变性5 min，然后进行扩增循环，包括变性1 min(94 ℃)、退火1 min (56 ℃)和延伸1 min(72 ℃)，34个循环，最后72 ℃延伸4 min。经凝胶成像系统的分析，分别计算Bcl-xl、p53与内参扩增带荧光强度×面积的比值，得出Bcl-xl、p53 mRNA的相对表达量。
2.5 统计学方法
实验数据以x±s表示，统计学处理采用SPSS 11.5软件，进行χ2、t检验。
3 结果
3.1 细胞形态观察
倒置显微镜观察到经白花蛇舌草处理48 h后的Bel7402细胞生长受到抑制，并出现贴壁生长细胞典型的凋亡形态变化现象，细胞由贴壁而脱落，浮悬于培养液中，细胞体积缩小、变圆，细胞透明度和细胞粘附力降低。而5-Fu阳性对照组上述现象更为明显。
3.2 各组肝癌Bel7402细胞的凋亡指数
经HE染色后，正常Bel7402细胞形态规整，呈多边形生长，可见细胞有伪足，核染成均一浅蓝紫色，核仁清晰可见。经过白花蛇舌草作用后，细胞形态发生了不同程度的变化，部分细胞的细胞质受到损伤，细胞核固缩，核染色质边集浓缩，呈现细胞凋亡特征。而经过5-Fu作用后，部分细胞发生自溶现象、细胞膜的连续性破坏，呈均质红染无结构物质，呈现细胞坏死特征。各组细胞凋亡指数见表1。表1 各组细胞凋亡指数(略)注：与空白对照组比较，#P&<0.01；与5-Fu阳性对照组比较，*P&<0.05
(下同)。
3.3 各组肝癌Bel7402细胞的生长抑制率
本实验以MTT显色法检测96孔板正常对照组、5-Fu阳性对照组、白花蛇舌草组3组细胞的吸光值，根据生长抑制率与吸光值呈反比的原理，按公式计算得知白花蛇舌草及5-Fu作用诱导株细胞抑制率。结果见表2。表2 各组细胞生长抑制率(略)
3.4 各组Bc1-xl和p53表达情况
以RT-PCR法将基因扩增后，琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪分析，结果见图1、表3。说明白花蛇舌草可激活抑癌基因p53、Bcl-xl基因表达。表3 Bc1-xl、p53基因表达的变化(略)
4 讨论
细胞凋亡调控是多基因参与的复杂网络系统。其中Bcl基因家族是重要的凋亡调控基因，包括抑凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl 和促凋亡基因如Bax、Bak、Bcl-xs等[2]。Bc1-xl表达与肿瘤发生有密切关系，并能抑制化疗等引起的细胞凋亡，而下调其表达则能促进凋亡发生[3]。有资料表明，Bc1-xl不仅在Bcl-2肿瘤(如乳腺癌)中高表达，而且在Bcl-2低表达的部分肿瘤中也呈高表达，提示其不仅抑凋亡作用强于Bcl-2，而且在细胞恶性转化过程中发挥了关键作用，在部分肿瘤中可能代替了Bcl-2功能[4]。p53基因是一种抑癌基因，定位在人第17号染色体短臂(17ql3)上，编码为一个由357个氨基酸组成的、相对分子质量为5.3×103的核酸蛋白[5]。正常细胞内的p53基因为野生型，具有抑癌功能，在癌组织中广泛表达。
本实验从抑制生长、诱导细胞凋亡方面研究白花蛇舌草对人肝癌Bel7402细胞诱导凋亡的作用及机制。发现100 mg/mL白花蛇舌草作用48 h后，HE染色、倒置显微镜下观察到染色质凝聚等凋亡细胞最典型的细胞形态学变化。白花蛇舌草体外具有抑制人肝癌Bel7402细胞生长、促进细胞凋亡作用，以MTT法检测细胞抑制率达61.5%，略低于5-Fu阳性对照组的74.6%。可以明显上调p53基因mRNA表达，降低Bcl-xl基因mRNA表达；证明其体外诱导细胞凋亡的分子机制是通过调控Bcl-xl和p53基因表达来诱导细胞凋亡。
参考文献
[1] 田代毕.实用中药大辞典[M](下卷).北京：人民卫生出版社，2002. 1265－1268.
[2] Krajewska M，Fenoglio-preiser CM.Immunohis to chemical analysis of Bel-2 family proteins in adenocareinomas of the stomach[J]. Am J Pathol，1996，140(5)：1449.
[3] He Uemans P，Van Dam PA.Prognostic value of Bel-2 expression in invasive breast cancer[J].Br J Cancer，1995，72(2)：354－355.
[4] Qu Y，Huang JM，Shan CG，et a1.The significance of immunohisto chemical testing p53 expression in nasopharyngeal lesions[J].Mod J Integr Tradit Chin West Med，2003，11(5)：448－449.
[5] 周建波.白花蛇舌草微量元素分析[J].中国中药杂志，1990，15(12)：36.