作者：王巍巍，魏义勇，石印玉
【摘要】 目的 观察核心结合因子α1(Cbfα1)在增龄成骨细胞中的表达，探讨补肾中药促进骨形成的新机制。方法 来源于不同年龄的大鼠成骨细胞被分离，采用组织块翻转方法培养。通过倒置显微镜观察细胞形态，矿化结节染色对成骨细胞加以鉴定。采用RT-PCR和免疫组化方法检测成骨细胞Cbfα1的表达。结果 RT-PCR和免疫组化结果表明，在增龄成骨细胞中，固本壮骨胶囊、金匮肾气丸和西药萌格旺可上调不同龄大鼠成骨细胞Cbfα1的表达，知柏地黄丸则下调Cbfα1的表达，补肾益精方对于不同龄大鼠成骨细胞Cbfα1表达的影响存在着区别。结论 补肾中药中的补阳中药具有促进骨形成的作用。
【关键词】 补肾中药；核心结合因子α1；成骨细胞；大鼠
Abstract：Objective To observe the expression of core-binding factor α1 (Cbfα1) in aging osteoblast， and try to provide new mechanisms of Chinese medicine on bone formation. Methods Rat osteoblast from different age donors (6 months and 16 months) were isolated and cultured by the tissue-fragment- migrating-growth method. The biological characteristic was observed by phase-contrast microscope and identified with mineralizing nodule staining. The expression of Cbfα1 was examined by RT-PCR and immunohistochemistry. Results RT-PCR and immunohistochemistry showed that the expression of Cbfα1 was upregulated by Gubenzhuanggu and Jinkuishenqi， and downregulated by Zhibaidihuang in aging osteoblast， but the effect was different on the Cbfα1 expression in Bushenyijing. Conclusion Buyang Chinese medicine among Bushen Chinese medicine promoted bone formation.
Key words：Bushen Chinese medicine；core-binding factor α1；osteoblast；rat
一般认为，骨代谢是维持骨组织不断更新、保持生命活力的基本过程，这一过程是依靠骨重建(bone remodeling)完成的。骨质疏松症骨丢失的潜在机理是骨重建过程的失调。目前的研究已证实核心结合因子α1(Cbfα1)是促进骨形成的关键因子。本实验以增龄大鼠成骨细胞为研究对象，探讨补肾中药对增龄成骨细胞Cbfα1的影响，以进一步提高补肾中药对骨质疏松症防治的有效性[1]。
1 实验材料
1.1 动物
正常6月龄及16月龄SD大鼠各2只，上海中医药大学实验动物中心提供。适应性饲养3 d后，提取骨组织以培养原代成骨细胞。正常6月龄SD大鼠70只，体重为(270±20)g，雌雄各半，上海中医药大学实验动物中心提供。适应性饲养3 d后，随机分为7组：正常组、生理盐水组、单味补阳组、复方补阳组、复方平补组、复方补阴组和西药对照组。灌胃后制备含药血清。
.2 药物、试剂和仪器
知柏地黄丸，兰州佛慈药厂生产，批号019804；补肾益精方，上海中医药大学附属曙光医院制剂室生产，批号010521；固本壮骨胶囊，浙江迪耳药业有限公司生产，批号021012；金匮肾气丸，兰州佛慈药厂生产，批号019604；萌格旺，日本帝人株氏会社生产，批号5699。所有药物用前均以蒸馏水配制成混悬液。
DMEM/HamF12(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(Promega，1∶250)；新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青霉素、链霉素(上海第二制药厂)；Trizol(Invitrogen)；RNA逆转录试剂盒(Biotech)；抗Cbfα1抗体及二抗(Santa Cruz)；SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德公司)。紫外分光光度计(Beckman，德国)；H6-1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)；PCR扩增仪(MJ Research)；紫外成像分析系统(上海天能科技有限公司)；Tanon GIS凝胶图像处理系统3.70版(上海天能科技有限公司)。
2 实验方法
2.1 成骨细胞培养
分别取6月龄和16月龄SD大鼠，0.3%戊巴比妥钠麻醉(1 mL/100 g)，无菌条件下取双侧股骨两端，剔除骨膜和周围结缔组织，无菌PBS液反复冲洗3次，剪成约1 mm3大小的骨粒，PBS液反复冲洗至骨粒呈白色，将骨粒均匀接种于含20%灭活新生牛血清DMEM/F12(1∶1)培养液的培养瓶中，翻转培养法培养于37 ℃、5% CO2培养箱中。2周后换液，以后每隔2 d换1次培养液，细胞生长融合达80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，以1.6×104个/cm2细胞密度接种于25 cm2培养瓶中。实验用第2代培养的细胞。
2.2 成骨细胞鉴定
成骨细胞汇合达80%后，0.25%胰酶消化，以3×105 个/mL密度接种于6孔培养板中，每隔2 d换液，观察矿化结节染色，橘红色为阳性。
2.3 制备含药血清
各实验组均按体表面积折算动物等效剂量的方法给予复方补阴中药知柏地黄丸、复方平补中药补肾益精方、单味补阳中药固本壮骨胶囊、复方补阳中药金匮肾气丸和西药萌格旺，于首次灌胃间隔2 h后再次给药，并于末次给药后1 h采血，对照组给予等量生理盐水灌胃，正常组自由进水。动物麻醉后，无菌条件下腹主动脉取血，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清，56 ℃、30 min灭活，经0.22 μm滤膜抽滤除菌，分装，-30 ℃保存备用。
2.4 含药血清对成骨细胞的干预
细胞接种于6孔培养板，当细胞汇合达60%，换无血清培养液培养细胞24 h后，加入各组含药血清(浓度为10%)再继续培养3 d，进行指标检测。
2.5 Cbfα1 mRNA的表达
引物：Cbfα1(205 bp) Sense：5’-GGTGGTCTGAGCTGGGATAC-3’， Antisense：5’-TAGGGTCAATGACACGACCA-，3’，GAPDH(214 bp) Sense：5’-AGCTGGTCATCAATGGGAG-3’，Antisense：5’-TCAGA TGCCTGCTTCATCAC-3’去细胞培养液，Trizol提取细胞总RNA，分光光度计测定RNA浓度后进行RT反应及PCR扩增。Cbfα1扩增条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，共循环30次，最后72 ℃延伸1 min。GAPDH基因扩增条件为94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，共循环35次，72 ℃延伸2 min。产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，应用图像分析仪对扩增条带的光密度进行测定，并计算该基因与GAPDH基因的光密度比值。
2.6 Cbfα1免疫组化染色
细胞以纯丙酮室温固定20～30 min，蒸馏水洗；甲醇加h3O2室温浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗；滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min滴加一抗(1∶200)，4 ℃过夜；0.1 mol/L PBS洗；滴加生物素化山羊抗大鼠IgG，20 min；0.1 mol/L PBS洗；滴加SABC试剂，20 min；0.1 mol/L PBS洗；DAB显色，蒸馏水洗。应用计算机图像分析系统对各组细胞进行光密度测定，检测细胞核灰度值。每组细胞平均取4个视野，每个检测视野均将背景灰度值确定为0～65。
2.7 统计学方法
计量资料均以x±s表示，将所得数据输入计算机分析系统，应用SPSS11.0软件，采用One-Way ANOVA进行检验。
3 结果
3.1 形态学观察
6月龄大鼠骨组织块24 h可贴壁，并见游离的小圆形细胞，3～5 d后骨粒边缘可见少量呈梭形、三角形的细胞移出。随着培养时间的延长，游移出的细胞呈三角形等形态，体积较小，胞体饱满，胞浆向外伸展，继而相邻细胞彼此贴靠或两者突起相连。16月龄大鼠镜下可见细胞悬液中的细胞呈圆形，大小不一。24 h后更换培养液可隐约看到部分细胞开始贴壁，变成椭圆形或梭形等。随着时间的延长，胞体逐渐增大，突起较长，汇合后呈长梭形。
3.2 矿化结节染色
6月龄及16月龄大鼠成骨细胞培养15 d后可见橘红色的矿化结节形成。
3.3 对不同龄大鼠成骨细胞Cbfα1 mRNA基因表达的影响
(见表1)表1 对不同龄大鼠成骨细胞Cbfα1 mRNA基因表达的影响（略）
3.4 对不同龄大鼠成骨细胞Cbfα1蛋白表达的影响
(见表2)表2 对不同龄大鼠成骨细胞Cbfα1蛋白表达的影响(略)注：与正常组、生理盐水组比较，*P&<0.05；与萌格旺组比较，#P&<0.05。
4 讨论
随着分子生物学的发展，人们对骨形成机制的探索也逐渐深入。研究发现，除了内分泌调控机制外，转录机制在骨形成调控中的重要性也不容忽视。最近已证实，成骨细胞内核连接因子家族Cbfα1在成骨细胞发育、分化和骨形成过程中起着至关重要的作用，尤其是其中的Cbfα1基因为成骨细胞特异性转录激活因子。Komori等[1-2]研究基因敲除的小鼠模型时发现，敲除Cbfα1基因的杂合子小鼠在出生时其骨组织发育明显受阻，而敲除Cbfα1基因的纯合子小鼠出生时无成骨细胞和骨组织的形成。由于Cbfα1基因缺失的小鼠出生后极易死亡，这就限制了对Cbfα1在出生后影响骨骼生长发育作用的研究。Ducy等[3]利用只在出生以后分化的成骨细胞中过度表达的Cbfα1 DNA 结合区的转基因小鼠进行研究，证明了Cbfα1除调节成骨细胞分化外，还控制出生后骨骼的形成和发育过程。另外，成骨细胞相关基因如骨钙素、骨桥蛋白、骨形成蛋白、Ⅰ型胶原等启动子中也发现有和Cbfα1结合的特异性DNA序列，Cbfα1同此序列结合后可以调节这些基因的表达水平。
中医药防治骨质疏松症的主要机制是促进骨形成，降低或减缓骨吸收，但究竟是如何促进骨形成、降低骨吸收，还不太清楚。本实验将药物血清学与分子生物学技术相结合，对其作用机制进行探讨。研究结果表明，西药萌格旺能明显上调Cbfα1基因的表达。结果证明了维生素D在骨质疏松防治中所具有的多靶点作用效应。补肾中药中，固本壮骨胶囊、金匮肾气丸之所以与萌格旺具有相似的作用，即上调Cbfα1基因的表达，可能与这些中药具有促进成骨细胞增殖，活化Cbfα1的基因有关；知柏地黄丸下调Cbfα1表达，与补阴中药抑制成骨细胞增殖有关，从而抑制了Cbfα1基因的表达。但是平补阴阳的补肾益精方对不同龄成骨细胞Cbfα1表达的影响却存在着区别，这种差异我们将在以后的实验中进一步进行探索。
【参考文献
】
[1] Komori T， Yagi H， Nomura S， et al. Targeted disruption of Cbfα1 results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts[J].Cell，1997，89(5)：755－764.
[2] Ducy P，S tarbuck M，Priemel M，et al.A Cbfα1-dependent genetic pathway controls bone formation beyond embryonic development[J].
Genes Dev，1999，13(8)：1025－1036.
[3] Ducy P， Zhang R， Geoffroy V， et al. Osf2/Cbfα1 ：a transcriptional activator of osteoblast differentiation[J]. Cell，1997，89(5)：747－754.