【摘要】 目的 建立高效液相色谱法测定川芎愈伤组织中阿魏酸含量的方法。方法 利用ZORBAX 300SB–C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，乙腈-1%三乙胺(15∶85)为流动相，检测波长为320 nm，流速1.0 mL/min，柱温为27 ℃，进样量20 μL。结果 阿魏酸在0.93～4.67 μg/mL范围内线性关系良好，r=0.999 8，平均加样回收率为99.98%，RSD＝1.63%。结论 该方法快速简便、准确可靠，可用于川芎愈伤组织中阿魏酸的含量测定。
【关键词】 川芎；愈伤组织；阿魏酸；高效液相色谱法
Abstract：Objective To establish a HPLC method for the determination of Ferulic acid in callus of Ligusticum chuanxiong. Methods The separation was performed on ZORBAX 300SB-C18 (250 mm×4.6 mm， 5 μm) column， using acetonitrile-1% triethylamine (15∶85) as mobile phase， detected at 320 nm. The flow rate was 1.0 mL/min， the column temperature was 27 ℃. Results The linear range of Ferulic acid was 0.93～4.67 μg/mL， r=0.999 8， the average recovery was 99.98% and RSD was 1.63%. Conclusion The method was rapid， simple， accurate and stability， and can be used for the quantitiative determination of Ferulic acid in Ligusticum chuanxiong callus.
Key words：Ligusticum chuanxiong；callus；Ferulic acid；HPLC
阿魏酸是药用植物川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)的主要成分。我们进行了川芎的组织培养，并利用HPLC法对愈伤组织中的阿魏酸进行含量测定，从而为利用细胞工程方法生产阿魏酸提供一定的试验依据。
1 实验材料
Agilent 1100 series 高效液相色谱仪。川芎愈伤组织为本研究室自培养，继代次数分别为第8代、第9代、第10代；阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号0773-9910)。试剂：甲醇、乙腈均为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
ZORBAX 300SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-1%三乙胺溶液(用磷酸将pH值调至3.0，15∶85)；检测波长：320 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：27 ℃；进样20 μL。
2.2 阿魏酸对照品溶液的配制
精密称取阿魏酸对照品0.93 mg于100 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，摇匀，配成9.3 μg/mL的溶液。
2.3 供试品溶液的制备
川芎愈伤组织供试品溶液制备：取川芎经粉碎的干燥愈伤组织0.5 g，精密称取，加甲醇-甲酸(95∶5)溶液20 mL，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)50 min，取出，放冷，过滤，收上清液，水浴蒸干，残渣用3 mL甲醇溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，备用。另取川芎对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。
2.4 检测波长的选择
取阿魏酸对照品溶液，置于紫外分光光度计中，在200～400 nm范围内进行扫描，结果在320 nm处有较大吸收峰，吸收度较强且不受溶剂峰的干扰，故选择320 nm处测定吸收波长。
2.5 线性关系考察
精密吸取对照品溶液100、126、167、251、502 μL，加甲醇定容至1 mL，摇匀，进样量为20 μL，以对照品峰面积Y为纵坐标，以进样浓度X(μg/mL)为横坐标进行线性回归，得回归方程为：Y＝416 126X－23.959，相关系数r＝0.999 8。表明阿魏酸在0.93～4.67 μg/mL浓度范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
精密吸取上述对照品溶液20 μL，重复进样5次，测得阿魏酸峰面积积分值分别为933.6、940.2、964.6、965.6、953.1，RSD＝1.51%，表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验
将待测样品溶液在室温下贮存，在相同的色谱条件下，每隔1 h进样1次，共5次，测得阿魏酸峰面积积分值分别为504.7、503、507.6、514.2、506.2，RSD＝0.85 %，表明样品溶液在5 h内基本稳定。
2.8 重复性试验
取同一代样品5份，每份0.8 g，精密称取，按“2.3”项下方法处理，残渣用0.5 mL甲醇溶解，测得阿魏酸峰面积积分值分别为1 486.1、1 479.4、1 454.9、1 505.8、1 515.2，结果求得含量的RSD＝1.59%。表明重现性良好。
2.9 加样回收率试验
采用加样回收法。精密称取已知含量(1.276 μg/mL)的样品，分别精密加入一定量的阿魏酸(1.556 μg/mL)对照品，按正文样品溶液的制备方法及上述的色谱条件，依法测定峰面积，计算回收率，结果平均回收率为99.98%，RSD＝1.63%。结果见表1。表1 加样回收率试验结果（略）
2.10 样品的含量测定
精密称取干燥愈伤组织粉碎品1.0 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，吸取20 μL注入高效液相色谱仪，测定含量，共测定3代。结果见表2，高效液相色谱图见图1。表2 样品中阿魏酸含量测定结果(略)
3 讨论
流动相的优化组合直接影响着样品中成分的分离。为了得到满意的分离效果，我们以甲醇与不同浓度的冰醋酸、乙腈与不同浓度的冰醋酸及磷酸溶液、乙腈-1%三乙胺溶液(用磷酸将pH值调至3.0)等多种流动相系统和配比进行样品分离，根据分离情况，选用乙腈-1%三乙胺溶液(15∶85)，结果峰形较好，且无拖尾现象。
我们在试验中发现，药材和愈伤组织中的成分虽然不能逐一确定，但是通过比较愈伤组织与药材的HPLC图谱(见图1)，发现愈伤组织和药材中的化学成分并不完全一致。即药材中不存在的成分，培养物中有可能存在；而药材中存在的成分，培养物中不一定产生。我们推测，可能不同药用成分基因的启动时间有差异，同时也可能是在植物生长发育过程的不同时间(愈伤组织、植株生长、药材成熟期)有效成分的生成及其累积量不同而造成的。
本试验表明，川芎愈伤组织中确实含有阿魏酸，但是相比于对照药材中的含量较低。我们可以通过选择不同的外植体、筛选高产细胞系、调控物理因子和化学因子及改变培养方法等刺激代谢产物的合成与积累。本研究为利用川芎组织培养进行阿魏酸的工业化生产提供了理论空间和试验依据。