作者：季旭明，王芳，张桂菊，陆国辉
【摘要】 目的 探讨康脑灵胶囊对痴呆大鼠神经元自由基损伤的保护作用及对caspase-3、Bcl-2表达的影响。方法 建立血管性痴呆大鼠模型，中药干预后，用分光光度计检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)的含量，荧光分光光度计检测caspase-3表达，流式细胞技术检测Bcl-2的表达。结果 康脑灵胶囊明显减少痴呆大鼠MDA含量，提高SOD、NO含量，降低caspase-3表达，增强Bcl-2表达。结论 康脑灵胶囊对缺血再灌注痴呆大鼠自由基损伤有明显保护作用，其作用机制与增强Bcl-2表达、降低caspase-3表达有关。
【关键词】 康脑灵胶囊；血管性痴呆；自由基损伤；Bcl-2；caspase-3；大鼠
Abstract：Objective To study the protection of Kangnaoling capsule to free radical injury and influence on the expression of caspase-3 and Bcl-2 in neuron of VD rat. Methods VD rat model was duplicated. Using spectrophotometry to detect contents of SOD， MDA and NO， spectro-fluorimeter to detect the expression of caspase-3， spectrophotometric method to detect the expression of Bcl-2 after traditional Chinese medicine interference. Results Kangnaoling capsule can markedly reduce the contents of MDA， raise contents of SOD and NO， degrade the expression of caspase-3， enhance the expression of Bcl-2. Conclusions Kangnaoling capsule can markedly protect VD rat from free radical injury， which probably correlated with increasing expression of Bcl-2， decreasing expression of caspase-3.
Key words：Kangnaoling capsule；vascular dementia；free radical injury；Bcl-2；caspase-3；rat
康脑灵胶囊由川芎、当归、银杏叶，淫羊藿等组成，功能活血化瘀、补肾益智，用于血管性痴呆的治疗[1]。研究表明，其能明显提高痴呆模型动物学习记忆能力，改善与学习记忆相关蛋白乙酰胆碱酯酶、神经生长因子的表达[2]。本研究对其抗缺血再灌注所致痴呆大鼠自由基损伤的保护作用及对凋亡调控蛋白Bcl-2、caspase-3表达的影响进行探讨，现报道如下。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级纯系Wister雄性大鼠50只，体重(250±50)g，山东医科大学动物实验中心提供，合格证号：D20041021。动物分笼饲养，自由饮水进食，标准饲料喂养，饲料由山东省实验动物中心提供。
1.2 药物
康脑灵胶囊，山东中医药大学附属医院制剂室提供，批号980421；西药对照药品为脑复康，天津金世制药有限公司生产，批号20030302。
1.3 试剂与仪器
Fluorescein(FITC) Bcl-2， ebioscience，批号11-6992；caspase-3/CCP32 Fluorometric Assay Kit，BioVision，批号K105-25；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供，批号：SOD、MDA为20041028，NO为20041030。FACSCaliber流式细胞仪，美国BD公司；BECKMAN-700全自动生化分析仪，美国贝克曼；RF-540型荧光分光光度计，日本岛津。
2 实验方法
2.1 造模、分组与给药
参照改良的四血管夹闭法制备大鼠脑缺血再灌注模型[3]。10%水合氯醛3 mL/kg(体重)腹腔麻醉，取仰卧位，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，穿线备用，用微型动脉夹关闭双侧颈总动脉10 min，再通10 min，反复3次，撤线，缝合。随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、脑复康对照组(C组)及康脑灵高(D组)、低(E组)剂量组。每组10只动物。A、B组予生理盐水灌胃，每日1次；C组给药量为0.28 g/kg；D组给药量为2.10 g/kg；E组给药量为1.05 g/kg。灌胃给药，每日1次，连续14 d。第15日大鼠断头处死，制备脑组织匀浆液及单细胞悬液备用。
2.2 分光光度法检测SOD、MDA、NO
各组大鼠断头后迅速制备脑组织匀浆液，用考马斯亮兰法蛋白定量后，按试剂盒说明书操作，测SOD、MDA、NO的吸光度值。
2.3 流式细胞仪检测Bcl-2的表达
各组大鼠断头后迅速取脑组织海马区，制备单细胞悬液，调整细胞数1×106/mL。按细胞内蛋白染色方法，加入20 μL Bcl-2抗体，染色30 min，流式细胞仪检测Bcl-2蛋白表达的荧光值。
2.4 荧光分光光度计检测caspase-3的表达
细胞悬液的制备同“2.1”项。按试剂盒说明书操作，荧光分光光度计测caspase-3荧光值。
2.5 统计学方法
用SAS软件单因素方差分析进行处理，计量资料以x±s表示。
3 结果
(见表1、表2)表1 康脑灵胶囊对痴呆大鼠脑组织匀浆中MDA、SOD、NO含量的影响(略)注：与A组比较，*P&<0.05，**P&<0.01；与B组比较，△P&<0.05(下同)。表2 康脑灵胶囊对痴呆大鼠神经细胞caspase-3、Bcl-2（略）注：与C组比较，▲P&<0.01。
4 讨论
血管性痴呆是多种因素参与的复杂病理过程，缺血再灌注损伤痴呆模型中自由基损伤有重要意义，氧自由基引起的组织脂质过氧化损伤是其重要原因[4]。缺血再灌注损伤后可产生高浓度活性氧(ROS)，包括超氧阴离子自由基(O2·)和NO等，氧自由基可损伤DNA，进而和其它机制一起最终导致细胞凋亡[5－6]。细胞凋亡是caspase家族参与的复杂过程，NO及其类似物可通过改变线粒体膜的通透性，导致一系列caspase家族酶系的活化，从而导致细胞凋亡[7]。Bcl-2基因是细胞凋亡的重要抑制基因，过高表达可防止或降低各种刺激如自由基、细胞因子等引起的细胞凋亡，其机理是通过抑制活性氧自由基的脂质过氧化作用而发挥抗凋亡活性[8]。有研究表明，补肾活血类中药具有清除自由基的作用[9]。本实验结果表明，康脑灵胶囊能显著降低模型动物脑组织中MDA含量，提高SOD、NO含量，SOD是机体清除自由基的重要酶类，通过清除多余自由基而保证人体代谢平衡[10]。康脑灵胶囊还可增强缺血再灌注损伤后Bcl-2的表达，降低caspase-3的表达。说明康脑灵胶囊具有抗氧化作用，可抵抗缺血再灌注后自由基大量产生，脑组织受氧自由基的损害减轻，保护脑神经细胞；并能调控凋亡、调节蛋白的表达，减少神经细胞凋亡的发生。所以，康脑灵胶囊预防脑神经细胞凋亡的机制可能与减轻脑内自由基水平、调控凋亡、调节蛋白的表达有关。
参考文献
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