作者：魏绍斌，曹亚芳，王毅，郭蓉晓，仝崇毅，谭亿民
【摘要】 目的 观察内异康复栓直肠给药对子宫内膜异位症大鼠异位和在位内膜雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)表达的不同影响，探讨其作用机理。方法 将子宫内膜异位症大鼠随机分为内异康复栓高、中剂量组及丹那唑组、丹莪妇康煎膏组、模型组、空白组，采用免疫组化SP法检测ER、PR的表达。结果 内异康复栓高、中剂量组能显著降低异位内膜ER、PR的表达(P&<0.05)，并对在位内膜下降的ER、PR水平有上调作用(P&>0.05)。结论 内异康复栓可能通过抑制异位内膜细胞内ER、PR的合成而发挥治疗作用，且对在位内膜异常的ER、PR表达有一定的调节作用。
【关键词】 子宫内膜异位症；内异康复栓；雌激素受体；孕激素受体；大鼠
Abstract：Objective To explore the different influence of Neyikangfu suppository (NYKFS) on ER and PR in ectopic and eutopic endometrium of endometriosis model rats by treatment of rectal administration. Methods Healthy and sexual matured female SD rats were taken as the researching objects and endometriosis model were achieved by autologous operation transplantation. Six groups were randomly formed and which were high-dose and middle-dose groups of NYKFS， Danazol capsule group and Danefukangjiangao (DEFKJG) group， model group and normal control group. Expressions of ER and
PR in ectopic and eutopic endometrium and endometrium of normal group was measured by immunohistochemical SP staining method. Results High-dose and middle-dose groups of NYKFS could obviously lower the expression of ER and PR in ectopic endometrium of endometriosis model rats. High-dose and middle-dose groups of NYKFS could increase the expression of ER and PR in eutopic endometrium to certain extent (P&>0.05). Conclusions NYKFS can inhibit the synthesis of ER and PR in cells of ectopic endometrium to treat endometriosis and have certain accommodation on abnormal expression of ER and PR in eutopic endometrium.
Key words：endometriosis；Neiyikangfu suppository；estrogen receptors；progesterone receptors；rat
子宫内膜异位症(EMT)是激素依赖性疾病，异位内膜的生长和维持依赖于周期性卵巢激素的刺激，需通过雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)发挥作用。异位内膜ER和PR的浓度不同于在位内膜且缺乏周期性变化[1]。以湿热瘀结立论的内异康复栓，具有清湿化瘀、行气止痛、消癥散结的功效，经直肠给药治疗EMT具有较好疗效。本实验采用免疫组化SP法，探讨内异康复栓对EMT模型大鼠异位和在位子宫内膜组织中ER、PR的不同影响，揭示内异康复栓直肠给药治疗EMT的作用机理。
1 材料与方法
1.1 动物
健康、性成熟、未交配过的雌性SD大鼠45只，体重180～250 g，一级动物，由成都中医药大学实验动物中心提供，合格证号：川实动管质第8号，批号：SCXK(川)2004-11。
1.2 药物
内异康复栓浸膏：成人每日用量0.2 g原药材/kg，成都中医药大学附属医院制剂室提供，批号050928；丹莪妇康煎膏：成人每日用量0.5 g/kg体重，昆明滇虹药业有限公司生产，国药准字Z20025253，批号050503；丹那唑胶囊：成人每日用量600 mg，上海华联制药有限公司生产，国药准字H31021681，批号050301。
1.3 试剂及仪器
一抗购自Santa Cruz Biotechnology，INC公司：ERα(MC-20)rabbit polyclonal IgG，200 μg/mL；PR(H-190) rabbit polyclonal IgG，200 μg/mL；二抗及相应试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。光学显微镜，型号：BH-2；数码摄像机，型号：TK-C1381EG；BIOMIAS图像分析系统。
1.4 造模
采用自体移植方法[2]建立EMT大鼠模型，2.5%戊巴比妥钠
(0.13 mL/100 g)腹腔内麻醉，待麻醉生效后，将大鼠固定在操作台上，腹部脱毛，常规消毒手术区皮肤，无菌操作，腹部正中纵切口，长约2 cm，开腹分离右侧子宫，结扎子宫两端及血管，切取右侧中段子宫。分离附着的脂肪和结缔组织后，将子宫纵形剖开，迅速分成约5 mm×5 mm大小的3段，分别种植在左卵巢、左子宫中段、左右子宫分叉处附近系膜上，内膜向下，直接与系膜紧贴，缝合切口，手术创面滴加庆大霉素预防感染。术后常规饲养。
1.5 分组及给药
造模30 d后随机抽取经剖腹证实造模成功后的动物，随机分为内异康复栓高[4.0 g/(kg· d)]、中剂量组[2.0 g/(kg· d)]及丹那唑组[0.2 g/(kg·d)]、丹莪妇康煎膏组[10.0 g/(kg· d)]、模型组、空白组。内异康复栓浸膏高、中剂量组直肠给药，丹莪妇康煎膏组和丹那唑组灌胃给药，模型组和空白组灌肠与内异康复栓高剂量组等容积的生理盐水。直肠给药前轻轻按摩并挤压大鼠肛门周围，促使直肠内积存的粪便排出，然后将直肠给药针头轻轻插入大鼠直肠约4.5 cm，将药液缓缓推入，勿将气泡推入，同时观察实验动物的状态。 给药后观察30 min，若有药液排出，即予补量。持续给药30 d。
1.6 标本的采集与处理
给药30 d，于末次给药后24 h脱颈椎处死大鼠，立即剖腹取异位病灶内膜组织和在位子宫送检。依据造模后病理组织形态学检查抽样结果，选取左侧子宫中段旁肠系膜异位内膜病灶及同侧子宫中段作为标本，置于10%中性福尔马林液中固定，送检。
1.7 异位和在位内膜ER、PR的染色及观察
将剖腹取出的异位种植内膜组织和左子宫(非手术侧)置于10%中性福尔马林液中固定，48 h后取出，经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(片厚4 μm)，采用免疫组化SP法染色。采用Mias图形分析系统，在200倍视野下，分别选择在位内膜组织的腺体中和异位内膜组织的被覆上皮含阳性物质(即棕黄色颗粒物质)最多的5个区域观察，测量阳性物质的积分光密度，以此表示ER、PR的表达情况。
1.8 统计学方法
所有数据均采用SPSS12.0统计软件进行处理，定量指标用单因素方差分析，组间比较用LSD、S-N-K分析和Tamhane’s T2检验。
2 实验结果
2.1 组织形态学变化
光镜下见异位内膜模型组子宫内膜形成环形封闭式结构，较在位内膜稍薄，有的有较多炎细胞浸润，宫腔被覆上皮呈假复层，部分呈复层排列，细胞拥挤，呈柱状，血管丰富；各治疗组异位内膜腺上皮变薄，呈单层排列，细胞呈低柱状甚至扁平状松散排列，细胞核呈圆形或椭圆形，间质细胞明显减少，甚至缺如，周围血管少。
在位内膜模型组腺体数目与空白组接近，腺上皮细胞立方状，排列较紧密，间质细胞呈梭状，排列紧密。各中药治疗组在位内膜腺体数目和腺上皮细胞及间质细胞与空白对照组比无明显改变。丹那唑组在位内膜腺体数目减少，有的腺腔消失，腺上皮细胞呈低柱状或扁平，排列稀疏，核小，染色浅，胞浆稀少，间质细胞呈长梭状，排列稀疏，染色浅。
2.2 内异康复栓对异位内膜ER、PR表达的影响
模型组ER、PR阳性物质呈棕黄色，分布致密；各治疗组ER、PR阳性物质呈浅棕色，分布稀疏；半定量测量结果见表1。表1 各组大鼠异位内膜ER、PR表达的比较(略)注：与模型组比较，*P&<0.05，**P&<0.01。
2.3 内异康复栓对在位内膜ER、PR表达的影响
(见表2)表2 各组大鼠在位内膜ER、PR表达的比较(略)注：与空白组比较，#P&<0.05，##P&<0.01；与模型组比较，★P&<0.05。
3 讨论
EMT是一种激素依赖性疾病，异位内膜组织激素受体表达状况直接影响本病的发生和发展。雌激素主要促使子宫内膜尤其是腺体的增生，而孕激素则使腺体分泌并抑制雌激素对内膜的增生刺激。它们互相协调，共同维持着内膜的正常生理功能。
正常子宫内膜中同时存在ER、PR，且呈周期性变化。由于雌激素可在转录水平促进ER、PR的合成，孕激素则在转录和转录后水平抑制二者的合成，因而正常子宫内膜受增殖期高雌激素和分泌期高孕激素的影响，其ER、PR在增殖期的表达高于分泌期，分泌晚期几乎消失[3]。郑氏[4]研究表明，异位内膜上绝对或相对减少的PR可能导致其降低或失去对雌激素控制的反应性，而相对较高的ER可能导致雌激素为主的环境，在EMT的发展中起作用。研究表明，阿拉瑞林能够抑制在位和异位内膜的生长，可能通过在位内膜ER起作用，但与异位内膜的ER和PR关系不肯定[5]。孕三烯酮可通过降低雌性大鼠体内雌孕激素水平以及下调子宫雌孕激素受体的表达，发挥对EMT的治疗作用[6]。杨氏等[7]研究发现，中药未能显著降低雌激素水平，却对ER、PR，尤其是异位内膜的ER、PR起降调作用，而对在位内膜的降调作用弱于丹那唑组。另有报道，中药消异康[8]、理气胶囊[9]能够降低EMT大鼠异位内膜ER、PR的含量。
本实验中各给药组均显著降低模型大鼠异位内膜ER、PR 的表达；丹那唑组明显降低模型大鼠在位内膜ER、PR的表达，内异康复栓高、中剂量组和丹莪妇康煎膏组能上调模型大鼠在位内膜下降的ER、PR水平。提示内异康复栓可能通过抑制异位内膜细胞内ER和PR的合成，降低异位内膜细胞内ER和PR浓度而发挥治疗EMT的作用，对在位内膜ER、PR的含量影响不明显，或可能对在位内膜异常的ER、PR含量有一定的调节作用。这也可能是中医药治疗EMT无抑制卵巢功能，且有调经助孕作用的机理所在。
【参考文献】
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