作者：王莹，刘春英，郭源秩，王哲，井欢，李淑玲，蔡硕，蔡玉文
【摘要】 目的 观察羟基喜树碱对体外A549人肺腺癌细胞增殖的影响。方法 采用细胞培养及MTT比色法检测羟基喜树碱对体外A549人肺腺癌细胞的抑制作用。结果 低浓度羟基喜树碱作用24 h对A549人肺腺癌细胞没有明显影响，当药物浓度达到50 μg/mL时，抑制作用明显增强，抑制率达44.17%，药物浓度达到100 μg/mL时抑制率达50.28%；随着药物作用时间的延长，抑制更明显，100 μg/mL药物组作用48 h抑制率达70.98%。结论 羟基喜树碱具有抑制A549人肺腺癌细胞增殖的作用，抑制作用具有明显的浓度和时间依赖性。
【关键词】 羟基喜树碱；A549人肺腺癌细胞；细胞培养；MT华强)
Abstract：Objective To observe the effect of Hydroxycamptothecin (HCPT) on proliferation of human lung cancer cell line A549 in vitro. Method Using cell calture and MTT assay to observe the effect of HCPT on proliferation of human lung cancer cell line A549. Result Lower concentration of HCPT had no evident inhibitory effect on the human lung cancer cell line A549 after 24 h. The effect was evident when the concentration of HCPT was up to 50 μg/mL， and the inhibitory rate was 44.17%. The inhibitory rate was 50.28% when the concentration of HCPT was up to 100 μg/mL. The inhibitory effect of HCPT became more significant with the stimulation of the time， and the inhibitory rate of 100 μg/mL concentration of HCPT was 70.98% after 48 h. Conclusions HCPT can inhibit the proliferation of human lung cancer cell A549 in vitro. The effect is dose and time dependent.
Key words：Hydroxycamptothecin；human lung cancer cell line A549；cell calture；MTT assay
羟基喜树碱(hydroxycamptothecin，HCPT)是天然生物碱，来源于我国特有且资源丰富的珙桐植物——喜树。Walla等[1]研究证明其对鼠白血病细胞有较高的抑制增殖作用。近年来，HCPT由于其抑制拓朴异构酶Ⅰ(TOPOⅠ)活性的独特抗癌机制而颇受国内外学者的关注[2]。本实验通过MTT分析法观察HCPT对A549人肺腺癌细胞增殖的抑制作用，从体外实验验证临床效果，为今后进一步探讨HCPT的其它抗癌机制奠定基础。
1 实验材料
1.1 药物和试剂
羟基喜树碱注射液(湖北黄石飞云制药有限公司，批号041201)。小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；RPMI-1640干粉(美国Gibco公司)；MTT及胰酶(华美生物工程公司)；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)。
1.2 细胞株
A549人肺腺癌细胞株，中国医科大学细胞生物教研室提供。
1.3 主要仪器
CO2恒温细胞培养箱(德国)，超净工作台(日本Sanyo公司产品)，倒置相差显微镜(日本)，酶标仪(台湾)。
2 实验方法
2.1 药液制备及分组
将一定量的羟基喜树碱注射液用适量的RPMI-1640完全培养液分别配成几种不同的浓度备用，终浓度分别为1、50、100 μg/mL。实验设不同浓度用药组、空白对照组。
2.2 细胞培养
将冻存于液氮中的安瓿取出，迅速放入37～40 ℃水浴中，使其在1 min内融化，无菌条件下打开安瓿，将细胞悬液吸取到培养瓶中，补足培养液后，置CO2培养箱(5% CO2，37 ℃)中培养。待细胞贴壁(约6 h后)，换培养液1次，至细胞长成单层后即可传代，用于实验。
2.3 细胞增殖的测定
采用MTT比色法来检测细胞存活情况。待细胞形成单层，用0.25%胰蛋白酶消化，10%小牛血清RPMI-1640培养液悬浮细胞，将细胞浓度调整为1×105 mL，接种至96孔培养板中，每孔0.2 mL细胞悬液，继续培养24 h后，弃培养液加无血清培养液，48 h同步化后，分别加入不同浓度的新鲜含药培养液(1、50、100 μg/mL)和无药培养液，每个浓度设8个复孔，培养24 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)液，继续培养4 h，弃上清，每孔加入100 μL DMSO终止反应，震荡10 min使液体混匀，应用酶标仪检测540 nm波长处的OD值。
2.4 药物对细胞增殖抑制时间依赖性的测定
细胞经过前述同步化处理后，分别加入不同浓度(1、50、100 μg/mL)的含药培养液，培养至8、12、24、48 h后，用MTT法检测，方法同“2.3”项。
2.5 统计学方法
实验数值以x±s表示，并采用两样本均数比较的t检验进行统计学处理。
3 结果
3.1 培养A549人肺腺癌细胞株的观察
首次换液，倒置相差显微镜下可见较多的细胞碎片，换液后视野变得较为清晰。细胞以突起相连接，核较大，胞质较少，核浆比例失调，细胞质透明。
3.2 不同浓度药物对细胞增殖的抑制
以各浓度(1、50、100 μg/mL)含药培养液温育A549人肺腺癌细胞株，作用24 h后，1 μg/mL药物组对细胞株未见明显抑制作用，其余各组均表现出明显抑制作用，100 μg/mL药物组最佳，抑制率达50.28%。见表1。表1 不同浓度HCPT作用24 h对A549人肺腺癌细胞株增 殖的抑制作用(略)注：与空白对照组比较，*P&<0.01。
3.3 药物对细胞抑制作用的时间依赖性
MTT法检测结果显示，HCPT在较低浓度(1 μg/mL)作用时间少于24 h基本不影响细胞生长，作用24 h后，药物对细胞的作用呈现出时间依赖性。当浓度为100 μg/mL时，早期(作用8 h)就出现明显的细胞生长抑制，抑制率达23.04%，作用48 h抑制率达70.98%，抑制作用与时间呈明显的依赖关系。
4 讨论
HCPT是喜树单体中抗肿瘤作用最强的微量植物碱，其主要作用机制是通过选择性地抑制TopoI，干扰DNA的复制、转录，从而抑制肿瘤细胞生长[3]。正常情况下，TopoI在切开单链DNA后，酶蛋白与末端DNA非共价结合形成一种暂时性的易解离复合物，并在此过程中完成切口的接合。HCPT可使这种易解离复合物趋于稳定和僵化，从而阻碍DNA复制、转录，这是HCPT独特的抗肿瘤机制[4]。近来，国内外学者仍在应用各种方法研究该药的抗肿瘤作用，探讨HCPT在肿瘤治疗上的其它作用机制。
本实验应用了MTT比色法，该法以代谢还原3-(4、5)- dimethy(thiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tertrazoliumbromide (MTT)为基础。活细胞的线粒体中存在与辅酶Ⅱ型相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶，死细胞则此酶消失，MTT不被还原。在一定细胞数范围内，蓝紫色结晶的量与存活细胞数成正比。研究发现，HCPT在体外对人肺腺癌A549细胞株增殖具有抑制作用，呈现明显的剂量及时间依赖性。今后，我们还会从不同的层面进一步研究HCPT对人肺腺癌A549细胞的作用及机制，为临床应用提供微观实验依据。
【参考文献
】
[1] Wall MF， Wani MC， Cook CE， et al. Plant antitunor agent.Ⅰ. The isolation and stucture of camptothecin，a novel alkaloidal leukemia and tunorin hahitor from camptotheca acurrinata[J].J Am Chem Soc，1996，88(1)：3 888－3 890.
[2] 祝葆华，姚榛祥.10-HCPT对人肝癌细胞HepG2体外生长及凋亡的影响[J].中华普通外科杂志，2005，20(2)：129－130.
[3] Hsiang YH，Hertzberg R，Hecht S，et al.CPT induces ptotain- linked DNA breaks via mammalian DNA topo Ⅰ[J].J Biochem，1985， 260：14873－14878.
[4] Zunino F， Dallavalleb S， Laccabuea D， et al. Status and perspectives in the development of camptothecins[J].Curr Pharm Des，2002，8：2505.