作者：尹智炜 高俊杰 陈志强 孙玉凤 丁奇峰 王月华 张江华
【摘要】 观察化瘀通络中药—肾络通对实验性大鼠糖尿病肾病(DN)模型肾功能及肾组织结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达的影响。方法 SD大鼠40只随机分为正常组、模型组、对照组和中药组，模型组、对照组和中药组应用链脲佐菌素(STZ) 60 mg/kg一次性腹腔注射制备大鼠糖尿病模型。中药组给予肾络通煎剂灌胃25 g/(kg·d)，对照组给予贝那普利水溶液10 mg/(kg·d)，正常组和模型组给予等量0.9%氯化钠注射液灌胃。检测各组大鼠24 h尿蛋白、血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和肾组织CTGF mRNA的表达。结果 模型组24 h尿蛋白、BUN、Cr和肾组织CTGF mRNA的表达均显著高于正常组(P&<0.01)；对照组和中药组24 h尿蛋白、BUN、Cr和肾组织CTGF mRNA的表达与模型组相比显著降低(P&<0.01)。结论 化瘀通络中药能够显著减少DN模型大鼠24 h尿蛋白，保护DN模型大鼠肾脏功能，并可从基因水平显著降低肾组织CTGF的表达，提示下调CTGF的表达可能是化瘀通络中药保护DN模型大鼠肾功能的重要机制。
【关键词】 糖尿病肾病 大鼠 SD 肾功能 结缔组织生长因子
【Abstract】 Objective To observe effects of dispersing blood stasis and dredging collateral—Shenluotong on renal function and expression of CTGF mRNA in diabetic nephropathy (DN) rats’ kidney.Methods The rats were randomly pided into four groups including normal group， model group， control group and Traditional Chinese Medicine (TCM) group. The DN model of rat was made through one-time injection of peritoneal of streptozotocin(STZ) 60 mg/kg.TCM group were intragastric administrated with Shenluotong 25 g/kg·d， Control group and the model group were intragastric administrated with benazepril 10 mg/kg·d， Normal group and model group were given equivalent physiological saline.24 hour urinary protein，Scr and BUN of different groups， and the expression of CTGF mRNA in nephridial tissue were detected.Results In comparison with normal group，24 hour urinary protein， Scr，BUN and the expression of CTGF mRNA in nephridial tissue of model group were increased obviously (P&<0.01);While in comparison with model group， those of TCM and Control group were decreased obviously (P&<0.01).Conclusion Dispersing blood stasis and dredging collateral can reduce 24 hour urinary protein， protect the renal function and down-regulate the expression of CTGF mRNA in nephridial tissue.It indicated that down-regulation the expression of CTGF maybe an important way of disperse blood stasis and dredge collateral protect rats’ renal function.
【Key words】 Diabetic nephropathy;Rat，SD;Renal function;Connective tissue growth factor
糖尿病肾病(diabetic Nephropathy， DN)泛指由于糖尿病导致的肾小球病变，因其明显的变化是细胞外基质(extracellular matrix， ECM)增生，所以又称糖尿病肾小球硬化症，是导致慢性肾衰竭(chronic renal failure， CRF) 的主要原因之一。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor， CTGF)是近年来研究发现的一种新的生长因子，其相关研究已经成为目前防治脏器纤维化的热点。它对肾细胞的分泌、增生及ECM的合成和降解具有重要的调控作用，其异常表达在肾纤维化进程中起着关键作用［1］。化瘀通络中药—肾络通是我们临床上治疗慢性肾脏疾病的基础方［2］。本实验应用链脲佐菌素(Streptozotocin， STZ)制备大鼠糖尿病模型，采用RT-PCR检测化瘀通络中药对其肾组织CTGF mRNA表达的影响，从分子水平探讨化瘀通络中药的可能作用机制，为中药治疗DN提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 动物
清洁级健康雄性Sprague-Dauley系大鼠40只，体质量(180±10)g，由河北医科大学动物实验中心提供，动物合格证号：冀医动管字07259号。
1.2 化瘀通络中药
肾络通，由地龙、乌梢蛇、丹参、黄芪等组成，按比例称取后，水煎、过滤，浓缩至含生药1.5 g/mL。装入瓶中密封保存于4℃冰箱中。饮片经过鉴定均为正品，由河北医科大学中医院制剂室提供，并经过鉴定均为正品。
1.3 造模与分组
大鼠自由饮水，常规饲料适应性喂养1周后，进行尿蛋白定性检测，结果全部为阴性。随机分为正常组、模型组、对照组和中药组，每组10只。除正常组外，其他各组按60 mg/kg一次性腹腔注射STZ，自由饮水、摄食，72 h后尾静脉取血快速血糖仪测随机血糖，以≥16.7 mmol/L为糖尿病模型成模标准［3］。正常组注射相应量0.9%氯化钠注射液。造模各组在糖尿病模型建立后，按血糖水平重新分组，组别与动物数不变。
1.4 给药与取材
成模后1周开始给药，中药组给予肾络通煎剂灌胃25 g/(kg·d)，对照组给予贝那普利水溶液10 mg/(kg·d)，对照组、中药组用药量均相当于临床人用剂量的20倍。正常组和模型组给予等量0.9%氯化钠注射液灌胃，均每日1次。
1.5 取材
给药第16周末，各组大鼠置于代谢笼中，禁食不禁水收集大鼠24 h尿液；10%水合氯醛30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，分离血清，然后迅速取肾组织置于液氮中，再转存于-70℃超低温冰箱中待检。
1.6 生化指标检测
双缩脲法定量24 h尿蛋白，Beckman cx7全自动生化分析仪检测血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)等生化指标。
1.7 CTGF mRNA检测
各组肾组织采用Trizol一步法提取总RNA，CTGF引物由上海中生生物工程公司合成，其序列为5′-GAA AGA CAG GTA CTA GCT GA-3′，5′-CGT ACC ATA TGT TCT GAC AG-3′；扩增产物长度为521 bp。GAPDH引物序列为5′-GTG CTG AGT ATG TCG TGG A-3′，5′-CAC AGT CTT CTG AGT GGC A-3′，扩增产物长度为298bp。选用美国Thermo Hybaid PCR仪，反应条为：①cDNA的合成和预变性：42℃，45 min；94℃，5 min；②PCR扩增：94℃，45 s；55.8℃，45 s；72℃，45 s；共35个循环；③循环完毕后72℃延伸7 min。PCR产物的定量分析以GAPDH校正做相对量分析，用图像析处理系统(UVP公司)进行灰度扫描，以CTGF与GAPDH之间光密度的比值表示CTGF mRNA的相对含量。
1.8 统计学处理
数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 11.5统计软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 各组大鼠24 h尿蛋白定量比较
见表1。表1 各组大鼠24 h尿蛋白定量比较（略）
由表1可见，模型组较正常组显著升高(P&<0.01)，提示糖尿病肾病模型造模成功；对照组、中药(TCM)组与模型组相比明显降低(P&<0.01)，而对照组与中药组之间无显著区别(P&>0.05)。
2.2 各组大鼠Cr和BUN比较
见表2。表2 各组大鼠Cr和BUN比较（略）
Cr和BUN模型组与正常组相比显著升高(P&<0.01)，对照组、中药组与模型组相比明显降低(P&<0.01)，但对照组、中药组BUN仍明显高于正常组(P&<0.01)，对照组与中药组之间差异无统计学意义(P&>0.05)。
2.3 各组对大鼠肾组织CTGF mRNA表达的影响
见表3。表3 各组对大鼠肾组织CTGF mRNA表达的影响（略）
RT-PCR半定量分析显示，模型组大鼠肾组织中CTGF mRNA表达较正常组显著增高(P＜0.01)，CTGF在中药组和对照组大鼠肾组织中表达量均较模型组显著降低(P＜0.01)
3 讨 论
化瘀通络中药—肾络通系经验方，临床治疗多种肾脏病取得了良好效果，对糖尿病肾病蛋白尿的疗效尤为显著。我们提出了结合临床实践，认为糖尿病肾病属于病久瘀血入于肾络，肾络瘀阻所致，属于肾中络脉为病。前期研究证实［4］，化瘀通络中药对高糖诱导足细胞产生MMP9具有调节作用，本实验进一步证实其对DN模型动物的肾功能具有显著的保护作用。
CTGF近年来发现的一种多功能细胞因子，它是一种富含半(CyR61)胱氨酸的多肽，是即刻早期基因CCN家族［包括CTGF、半胱氨酸蛋白61(CYR61)等］成员之一，有介导细胞的迁移、趋化、黏附、积聚，诱导增生、细胞凋亡和胶原生成的作用［1］。CTGF过度表达与增生性或纤维化性疾病的发生密切相关，在体内外转化生长因子β1(TGF-β1)可以特异性地诱导CTGF的表达，反过来CTGF又介导TGF-β对间质细胞的作用，可促进细胞增生和ECM合成等［5］。国内外均有研究报道［6，7］，在糖尿病尿白蛋白正常患者的肾组织中CTGF的表达已显著升高，随着糖尿病肾脏损害的加重CTGF的表达进一步增强，说明CTGF参与DN的发生发展，CTGF的表达高低并与糖尿病肾脏损害的程度密切相关。
在本实验中我们应用化瘀通络中药干预STZ制备的大鼠DN模型，检测了大鼠24 h尿蛋白、肾功能(Cr和BUN)以及肾组织CTGF mRNA表达的改变。结果表明，DN模型大鼠肾组织CTGF的表达显著升高，化瘀通络中药能够显著减少DN模型大鼠24 h尿蛋白，保护DN模型大鼠肾脏功能，并可从基因水平显著降低肾组织CTGF的表达，提示下调CTGF的表达可能是化瘀通络中药保护DN模型大鼠肾功能的重要机制。
参考文献
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