作者：宋建平，李伟，刘方州，李瑞琴，张瑞
【摘要】 目的 探讨金匮肾气丸防治肺纤维化作用机理。方法 用平阳霉素复制肺纤维化模型大鼠后，用药组每天灌胃金匮肾气丸，28 d后处死，观察、比较各组大鼠肺组织中转化生长因子β1(TGF-β1)的表达。结果 模型组大鼠肺组织中TGF-β1表达均明显高于正常对照组及用药组(P&<0.05)。结论 金匮肾气丸能明显抑制肺组织中TGF-β1过度表达。
【关键词】 肺纤维化；转化生长因子β1；金匮肾气丸
Abstract：Objective To investigate the effect and mechanism of Jinkuishenqi wan (JGSQ) on pulmonary fibrosis. Methods Pulmonary fibrosis was induced by bleomycinA5 in SD rats. Rats in treatment group were killed after being treated by JGSQ daily for 28 days. The lungs of all rats were harvested for histopathological studies. The contents of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in lungs were measured and compared. Results The contents of TGF-β1 in lungs increased significantly in model group as compared with normal group and treatment group (P&<0.05). Concluision JGSQ could significantly alleviate the increased TGF-β1 expression in lung of pulmonary fibrosis rats. Key words：pulmonary fibrosis；transforming growth factor-β1；Jinkuishenqi wan 肺间质纤维化是多种间质性肺病的不良转归，目前尚无治疗良策。我们曾观察到金匮肾气丸能明显减轻平阳霉素所致的大鼠肺泡炎及纤维化程度[1-2]，本实验进一步观察了金匮肾气丸对平阳霉素所致的肺纤维化大鼠肺组织中转化生长因子β1 (TGF-β1)表达的影响，以探讨其防治肺纤维化作用机理。
1 实验材料
1.1 动物 普通级健康SD雌性大鼠，体重180～210 g，河南省动物实验中心提供，饲养于河南省中医药研究院动物观察室，室温(22±2)℃，相对湿度60%，常规饲料喂养，饮水量不限。
1.2 主要药物、试剂及仪器
平阳霉素，天津太河制药有限公司产品，批号PBW020501，使用时用生理盐水配制成3 mg/mL；金匮肾气丸，河南宛西制药厂产品，批号991114；氢化可的松针剂，南阳普康制药有限公司，批号020820。兔抗人、鼠TGF-β1多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司产品，编号BA0290；即用型SABC免疫组化试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司产品，编号SA1022；DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司产品，编号ED1022。L-200型万分之一精密分析天平，日本岛津；HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统，同济医科大学千屏影像工程公司。
2 实验方法
2.1 分组
将动物按随机数字表法随机分为正常对照组、模型对照组、金匮肾气丸组、西药对照组，除正常组动物为10只外，其余各组动物均为12只。
2.2 动物造模与用药
正常对照组正常饲养不作任何处理，模型对照组及用药组大鼠造模。以氯胺酮腹腔麻醉大鼠，取仰卧固定位，常规消毒，行颈正中切口，钝性分离暴露气管，经气管软骨环间隙向心端穿刺注入平阳霉素(3 mg/kg体重)生理盐水溶液，立即将动物直立并行旋转，使药液在肺内分布充分、均匀，缝合皮肤，待动物自然清醒后置笼内常规饲养。造模后第2天开始用药，金匮肾气丸组按2.25 g/kg体重配制2 mL药液灌胃，模型对照组灌胃等量去离子水，西药对照组腹腔注射氢化可的松5 mg/kg体重，每天给药1次，每周复查动物体重以调整给药量，共用药28 d。
2.3 取材、检测指标与方法
实验结束时腹主动脉取血处死动物，摘取肺脏，取左肺外侧矢状面用4%多聚甲醛固定液固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，干燥、脱蜡后，以免疫组化法检测肺组织中TGF-β1表达。①载玻片防脱片处理。②肺组织常规固定，切片。③切片脱蜡、水洗，去除内源性过氧化物酶后水洗、修复。④滴加正常山羊血清封闭液。⑤滴加最佳稀释度的一抗于湿盒中。⑥0.1 mol/L PBS洗，滴加生物素标记二抗，PBS洗5 min×3次。⑦滴加SABC，PBS洗5 min×3次。⑧DAB 显色，光镜下控制显色程度中止反应，蒸馏水冲洗切片。⑨苏木素轻度复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗还蓝。梯度酒精逐级脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。
用HPIAS-1000计算机图像分析系统对染色后的切片进行定量分析，免疫组化切片以细胞胞浆中呈清晰棕黄色为阳性，按染色程度不同分为5级：胞浆深棕色(4分)；胞浆棕黄色(3分)；胞浆淡黄色(2分)；微染色(1分)；无着色(0分)。计算每张切片阳性细胞染色积分。高倍镜下观察，随机选上、下、左、右、中央5个视野，以病灶边缘正好进入检测光栏为准，测定标准测量光栏中阳性区域百分比、平均灰度和积分光密度。平均灰度和积分光密度可相对定量反映免疫组化阳性强弱的变化：平均灰度与免疫组化阳性染色程度呈负相关(平均灰度值大则阳性表达弱)；积分光密度与免疫组化染色程度呈正相关。
2.4 统计学方法
数据采用SPSS 10.0统计软件进行处理。对服从正态分布的组间计量资料数据以x±s表示，组间差异性判断采用单因素方差分析，方差齐时用LSD法，方差不齐时用Dunnett T3检验。
转贴于 3 结果
实验结束时，模型组死亡4只，金匮肾气丸组死亡2只，西药对照组死亡6只。镜下观察正常对照组大鼠肺组织切片肺泡巨噬细胞、肺间质结缔组织、血管内皮及平滑肌细胞可见少许阳性棕黄色产物分布。模型组大鼠可见棕黄色颗粒状或丝网状阳性表达产物明显增多，在支气管上皮细胞也出现明显的棕黄色反应产物。西药组动物肺组织中TGF-β1蛋白质表达量较模型对照组明显减少。西药组的阳性面积百分比与积分光密度均低于模型组(P&<0.05)；用药组的灰度值均高于模型组(P&<0.05)，提示金匮肾气丸和氢化可的松均可抑制肺纤维化大鼠肺组织中TGF-β过度表达，氢化可的松作用可能强于金匮肾气丸。结果见表1、表2。表1 各组大鼠肺组织中TGF-β1分布积分比较(略)注：方差齐性检验，P巨噬细胞=0.611，P上皮细胞=0.000，P间质细胞=0.412，P平滑肌细胞=0.146，P周围组织=0.907；与正常对照组比较，▲P&<0.05；与模型对照组比较， ★P&<0.05；与金匮肾气丸组比较，◆P&<0.05(下同)。表2 各组大鼠肺组织中TGF-β1表达比较(略)
4 讨论
细胞因子在肺纤维化中的作用是目前研究热点，TGF-β被大多数学者公认为是肺纤维化形成和发展的关键性细胞因子。TGF-β至少有5种异构体，其中TGF-β1致纤维化作用最突出。一方面，TGF-β能刺激细胞外基质(ECM)各种成分合成增多；另一方面，它可抑制蛋白水解酶的表达，抑制纤溶酶原、胶原酶原、基质酶原等酶原激活物产生，诱导蛋白水解酶抑制物的合成，从而减少ECM的降解，使ECM沉积增多，引起肺纤维化[3]。
肺间质纤维化目前尚无治疗良策。西医防治多首选皮质激素，但仅部分患者有显著疗效，且使用激素不良反应多。本实验结果表明，氢化可的松有明显抑制肺组织TGF-β1过度表达的作用，然死亡率较高，与文献报道用氢化可的松制作的肾阳虚模型小鼠7 d后死亡率达50%[4]结果相似，提示应充分重视皮质激素防治肺纤维化时的不良反应。
中医药防治肺纤维化的报道近年逐渐增多，显示了可喜前景。肺纤维化以进行性呼吸困难为特征，患者呼吸气促，动则喘甚，根据其临床表现，不少医家将其归于“喘证”、“肺痿”等范畴，认为肾虚是其重要病机。金匮肾气丸为补肾名方，常用于治疗肾虚而喘。有文献报道，肾气虚、肾阳虚老人服用金匮肾气丸后总肺活量、最大呼气第一秒量、第一秒/总肺活量均有提高[5]。
我们过去曾观察到金匮肾气丸有减轻平阳霉素所致的大鼠肺泡炎及纤维化程度的作用，本实验结果表明，金匮肾气丸组肺组织中TGF-β1表达量较模型对照组明显减少，提示抑制肺TGF-β1过度表达可能是该药减轻肺间质纤维化的作用机制之一。
参考文献
1] 宋建平，刘方州，李瑞琴，等.麦门冬汤、栝楼薤白汤与肾气丸对平阳霉素所致肺纤维化的影响[J].国医论坛，2001，(4)：40－41.
[2] 宋建平，李瑞琴，张 瑞，等.肾气丸对肺纤维化大鼠肺组织及血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响[J].中国中医基础医学杂志，2005，(6)：418－419，424.
[3] 崔晓利，刘海玲，董 秀，等.转化生长因子β1表达在小鼠放射性肺纤维化形成过程中的作用[J].中华放射肿瘤学杂志，1999，8(1)：47－49.
[4] 姚晓渝，周恩平，孙经纬，等.金匮肾气丸对“阳虚”模型动物血液和脑组织中超氧化物歧化酶活力的影响[J].中国药学杂志，1989，24(5)：283.
[5] 刘浙伟.金匮肾气丸为主改善老年人SOD、LPO等衰老指标的观察[J].新中医，1996，28(11)：59.